L-高絲氨酸和甲硫醇轉化為L-甲硫氨酸和H 3P〇d9酶活性。與SEQ ID No :6至29中任一個所示的序列的序列等同性至少為60%，優選至少為70%，甚至更優選 至少80%，至少85%，至少90%或至少95%并最優選至少96%、97%、98%或99%。優選 地，等同性的程度通過將相應序列與SEQ ID No :6至29中任一個所示的氨基酸序列對比確 定。當對比的序列不具備同樣的長度，等同性程度優選指在較短序列中氨基酸殘基與在較 長序列中氨基酸殘基等同的百分比或指在較長序列中氨基酸殘基與在較短序列中氨基酸 殘基等同的百分比。序列等同性的程度可以根據本領域熟知的方法，優選使用適宜的計算 機程序如CLUSTAL確定。
[0023] 當使用CLUSTAL分析方法來確定特定的序列是否例如80%等同于參照的序列，可 以使用默認設置或優選以下設置：矩陣：代矩陣30 ;開放空位罰分：10. 0 ;延伸空位罰分： 0. 05 ;延遲失真：40 ;空位分離距離：8,用于對比氨基酸序列。對于核苷酸序列對比，延伸空 位罰分優選設置在5.0。
[0024] 優選地，在序列的完整長度上計算等同性程度。此外，如果在本發明的上下文中使 用"同源性"，此術語優選表示"序列等同性"。
[0025] 根據本發明的方法還允許制備其他衍生自L-甲硫氨酸的含硫化合物。所述化合 物的例子是S-腺苷甲硫氨酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、S-腺苷高半胱氨酸、甲硫基腺苷和2-氧 代-4-甲硫基丁酸酯。
[0026] 因此，本發明還涉及用于制備S-腺苷甲硫氨酸的方法，其包括如上所述的根據本 發明的用于制備L-甲硫氨酸的方法并且其中將L-甲硫氨酸根據以下反應進一步轉化為 S-腺苷甲硫氨酸：
[0027] 甲硫氨酸+ATP=>S_腺苷甲硫氨酸+PPi+Pi
[0028] 此通過酶的反應在本領域中已知并且催化此反應的酶在本領域中已知。這些酶被 稱為S-腺苷甲硫氨酸合酶（EC 2. 5. 1. 6)。對應酶的實施例為酵母中的SAM1和SAM2。因 此，在所述方法在生物體中進行的情況下，所述生物體優選過度表達對應的能將L-甲硫氨 酸轉化為S-腺苷甲硫氨酸的酶。
[0029] 也可能有利地將所述生物體進一步修飾從而避免S-腺苷甲硫氨酸的通量進入其 他代謝途徑。在酵母中，例如有可能有利地失活腺苷激酶的活性（EC 2. 7. 1. 20,在酵母中通 過AD01基因編碼）從而將S-腺苷甲硫氨酸的通量降低至S-腺苷高半胱氨酸。
[0030] 此外，本發明還涉及用于制備半胱氨酸的方法，其包括如上所述的根據本發明的 用于制備L-甲硫氨酸的方法并且其中L-甲硫氨酸被進一步轉化為半胱氨酸。本領域已知 L-甲硫氨酸至半胱氨酸的轉化并且該轉化可以通過本領域技術人員已知的方式和方法實 現。例如，可以首先將L-甲硫氨酸轉化為S-腺苷甲硫氨酸，其之后進一步根據以下反應被 轉化為S-腺苷高半胱氨酸：
[0031]S-腺苷甲硫氨酸+甲基受體=>s-腺苷高半胱氨酸+甲基化受體
[0032] 此反應通過依賴S-腺苷甲硫氨酸的甲基轉移酶催化。
[0033]S-腺苷高半胱氨酸可以之后根據以下反應被進一步轉化為L-高半胱氨酸：
[0034]S-腺苷高半胱氨酸〈=>L_高半胱氨酸+腺苷
[0035] 此反應通過S-腺苷高半胱氨酸水解酶，EC3. 3. 1. 1催化。
[0036] 之后L-高半胱氨酸可以根據以下反應被轉化為L-胱硫醚：
[0037]L-高半胱氨酸+L-絲氨酸〈=>L_胱硫醚+H20
[0038] 此反應通過胱硫醚0合酶（EC4. 2. 1. 22)催化。
[0039] 最終，L-胱硫醚根據以下反應被轉化為半胱氨酸：
[0040]L-胱硫醚+H20〈 = >L_半胱氨酸+NH3+氧代丁酸酯
[0041] 此反應通過胱硫醚Y_裂合酶催化（EC4. 4.1. 1)。
[0042] 如果所述方法在酵母中進行，有利地過度表達以下基因：SAM1、SAM2、SAH1、STR4 和STR1。此外，應將編碼酵母胱硫醚Y合酶的基因STR2刪除從而降低從半胱氨酸至高半 胱氨酸的反向合成。類似地，所述酵母還有利地包括MET突變，其廢除依賴甲基四氫葉酸的 甲硫氨酸合酶以及去除DUG2基因，其在主要的谷胱甘肽降解途徑中涉及。
[0043] 此外，本發明還涉及用于制備谷胱甘肽的方法，其包括上述根據本發明的用于制 備L-甲硫氨酸的方法并且其中將L-甲硫氨酸進一步轉化為谷胱甘肽。本領域中已知L-甲 硫氨酸至谷胱甘肽的轉化并且該轉化可以通過本領域技術人員已知的方式和方法實現。例 如，L-甲硫氨酸可以首先被轉化為S-腺苷甲硫氨酸，其之后進一步如上所述被轉化為胱氨 酸并且由此制備的胱氨酸根據以下反應被進一步轉化為Glu-Cys(y-L-谷酰基-L-胱氨 酸）：
[0044]ATP+L-谷氨酸酯+L-胱氨酸〈=>y-L-谷酰基-L-胱氨酸+ADP+Pi
[0045] 此反應通過谷氨酸半胱氨酸連接酶（EC6. 3. 2. 2)催化。
[0046] 由此制備的Glu-Cys之后根據以下反應被進一步轉化為谷胱甘肽：
[0047]ATP+y-L-谷酰基-L-胱氨酸+甘氨酸=谷胱甘肽+ADP+Pi
[0048] 此反應通過谷胱甘肽合酶（EC6. 3. 2. 3)催化。
[0049] 如果所述反應在酵母中進行，優選聯系用于制備胱氨酸的方法如上設計酵母并且 所述酵母也應過度表達在胱氨酸至谷胱甘肽的轉化中涉及的基因GSH1和GSH2。在特別優 選的實施方案中，GSH1基因表達了耐反饋的酶。
[0050] 此外，本發明還涉及用于制備2-氧代-4-甲硫基丁酸酯的方法，其包括根據如上 所述的本發明的用于制備L-甲硫氨酸的方法并且其中L-甲硫氨酸根據以下反應被進一步 傳化為2-氧代-4-甲硫基丁酸酯：
[0051] 甲硫氨酸+2-氧代酸=>2-氧代-4-甲硫基丁酸酯+L-氨基酸
[0052] 本領域已知此通過酶的反應并且本領域已知催化此反應的酶。這些酶被稱為甲 硫酸氨轉氨酶（EC2. 6. 1.88)。對應的酶的例子是酵母中的八1?08、841'1、8412。因此，在所 述方法在生物體中進行的情況下，所述生物體優選過度表達能將L-甲硫氨酸轉化為2-氧 代-4-甲硫基丁酸酯的對應的酶。
[0053] 也有可能有利地將所述生物體進一步修飾從而避免2-氧代-4-甲硫基丁酸酯 的通量進入其他代謝途徑。在酵母中，例如有可能有利地失活苯丙酮酸脫羧酶的活性 (EC4. 1. 1. 43,通過酵母中AR010基因編碼）或丙酮酸脫羧酶的活性（EC4. 1. 1. 1，通過酵母 中H)C1、PDC5和H)C6基因編碼）從而將2-氧代-4-甲硫基丁酸酯的通量降低至3-(甲硫 基）丙醛。
[0054] 根據本發明的方法可以在體外或體內進行。體外反應被理解為是其中不使用細胞 的反應，即，非細胞的反應。因此，體外優選表示沒有細胞的體系。在一個實施方案中，術語 "體外"表示存在分離的酶。在一個實施方案中，在方法中使用的酶以純化的形式使用。
[0055] 為了在體外進行所述方法，用于反應的底物和酶在使酶具有活性并且使通過酶的 轉化發生的條件下（緩沖液，溫度等）培育。使所述反應進行足夠的時間以制備L-甲硫氨 酸。L-甲硫氨酸的制備可以通過本領域已知的方法測量。
[0056] 所述酶可以是任意使通過酶的反應發生的適宜形式。其可以被純化或部分純化或 以粗細胞提取物的形式或部分純化的提取物的形式。也有可能將酶固定在適宜的載體上。
[0057] 在另一個實施方案中，根據本發明的方法在培養液中，在生物體，優選微生物的存 在下進行，制備的蛋白質具有將〇-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇轉化為L-甲硫氨酸和H 3P04 的能力。此蛋白質是本文中所述的蛋白質。
[0058] 在所述方法中使用的生物體優選為本文所述的根據本發明的宿主細胞。
[0059] 本發明還涉及具有將0-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇通過酶轉化為L-甲硫氨酸的 能力的蛋白質。在本發明的上下文中，所述酶指依賴0HPS的甲硫氨酸合酶。如上所述，目 前沒有報道表明天然存在具有將0-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇轉化為L-甲硫氨酸的蛋白 質并且本發明是首次提供此類允許如上文所述的根據本發明的方法制備L -甲硫氨酸的 蛋白質。
[0060] 在優選的實施方案中，根據本發明的具有將0-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇通過酶 轉化為L-甲硫氨酸的能力的蛋白質通過突變衍生自胱硫醚Y合酶（EC 2. 5. 1. 48)。所述 突變可以是在胱硫醚Y合酶（EC 2. 5. 1. 48)的氨基酸序列中，一個或更多個氨基酸殘基的 取代和/或一個或更多個氨基酸殘基的刪除和/或一個或更多個氨基酸殘基的加入。
[0061] 已知并描述了用于各種生物體的胱硫醚y合酶。例如，對于植物，已知大于350 個用于胱硫醚y合酶的序列，尤其是用于擬南芥、煙草、小麥、番茄、稀脈萍、馬鈴薯、菠菜、 總狀紫云英、雙溝黃芪、紫云英和抱莖假含羞草。
[0062] 還已知來自細菌和真菌的胱硫醚y合酶。對于細菌，已經描述了大于22000個 序列并且對于細菌和真菌序列的例子是源自釀酒酵母、粗糙鏈孢霉、腸道沙門氏菌、大腸桿 菌、根癌土壤桿菌、糞產堿菌、解硫胺素芽孢桿菌屬、短小芽胞桿菌、枯草桿菌、谷氨酸棒狀 桿菌、幽門螺桿菌、球形芽孢桿菌芽孢桿菌、結核分枝桿菌、胡蘿卜軟腐果膠桿菌、德阿昆合 假單孢菌、戀臭假單胞菌、產褐色鏈霉菌。
[0063] 用于提供顯示將0-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇轉化為L-甲硫氨酸和H 3P04的活 性的蛋白質的方法在所附實施例中描述并將在下文更詳細地描述。原則上，可以使用任意 的胱硫醚Y合酶（EC 2. 5. 1. 48)作為初始材料來提供顯示將0-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫 醇轉化為L-甲硫氨酸和呀04的活性的蛋白質。優選將0-磷酸-L-高絲氨酸和甲硫醇轉 化為L-甲硫氨酸和氏?0 4的活性的蛋白質，其衍生自胱硫醚Y合酶（EC 2.5. 1.48)，顯示 與天然存在的胱硫醚y合酶至少70%，優選至少80%，甚至更優選至少90%和最優選至少 95%的序列等同性。
[0064] 在一個優選的實施方案中，從其衍生依賴0HPS甲硫氨酸合酶的胱硫醚Y合酶 (EC 2. 5. 1. 48)為植物胱硫醚y合酶（EC 2. 5. 1. 48)，優選來自擬南芥的胱硫醚y合酶 (EC 2. 5. 1. 48)CGS1，最優選的胱硫醚y合酶（EC 2. 5. 1. 48)顯示SEQ IDNo :1所示的氨 基酸序列。在甚至更優選的實施方案中，在根據本發明的方法中使用的依賴0HPS的甲硫 氨酸合酶衍生自SEQ ID N〇:2顯示的序列。除了實際上在84位上的甘氨酸殘基通過絲氨 酸殘基替換，此序列對應SEQ ID No :1。此替換，即mto突變，解除了通過S-腺苷甲硫氨 酸在 CGS1 上施加的翻譯抑制（Onoue 等，Journal of Biological Chemistry 286(2011)， 14903-14911)。在特別優選的實施方案中，在根據本發明的方法中使用的依賴0HPS的甲硫 氨酸合酶衍生自SEQ ID No :3顯示的序列。除了實際上胺基位于末端的以葉綠體為目標的 序列（氨基酸殘基1至57)已被移除并且將甲硫氨酸殘基在N-末端加入，此序列對應SEQ ID No:2