蛋白質中至少另一個氨基 酸殘基在選自位置 10、11、15、27、28、30、32、45、47、60、68、104、150、178、183、185、220、232、 245、257、259、261、275、287、289、324、326、371、396、405、431、436、457、459、470、472、506 和 507,優選選自位置 10、11、15、30、32、45、47、68、104、150、178、183、185、220、232、245、257、 259、261、275、287、289、326、371、396、405、431、436、459、470、472、506 和 507,甚至更優選 選自殘基275和396的位置被取代。
[0148] 在一個實施方案中，其中存在取代和/或刪除的位置如下：
[0149] 在一個實施方案中，其中存在取代和/或刪除的位置如下：位置10、27、60、324和 457。
[0150] 在一個實施方案中，其中存在取代和/或刪除的位置如下：位置32、287、289和 356〇
[0151] 在一個實施方案中，其中存在取代和/或刪除的位置如下：位置10、232、245、259、 356、431 和 436。
[0152] 在一個實施方案中，其中存在取代和/或刪除的位置如下：位置11、15、30、45、47、 68、178、356、371和 459。
[0153] 在一個實施方案中，其中存在取代和/或刪除的位置如下：位置32和356。
[0154] 在一個實施方案中，其中存在取代和/或刪除的位置如下：位置32、60、324和 457。
[0155] 在一個實施方案中，其中存在取代和/或刪除的位置如下：位置32、287、289和 356〇
[0156] 在一個實施方案中，其中存在取代和/或刪除的位置如下：位置32、232、245、259、 356、431 和 436。
[0157] 在一個實施方案中，其中存在取代和/或刪除的位置如下：位置32、45、47、68、 178、356、371和 459。
[0158] 在一個實施方案中，其中存在取代和/或刪除的位置如下：位置232、245、259、 356、431 和 436。
[0159] 在一個實施方案中，其中存在取代和/或刪除的位置如下：位置178、356、371和 459〇
[0160] 在一個實施方案中，其中存在取代和/或刪除的位置如下：位置150、257、259、 261、275、289、356 和 506。
[0161] 在一個實施方案中，其中存在取代和/或刪除的位置如下：位置185、356和405。
[0162] 在一個實施方案中，其中存在取代和/或刪除的位置如下：位置275、356、396和 472。
[0163] 在一個實施方案中，其中存在取代和/或刪除的位置如下：位置275、326、356和 396〇
[0164] 在一個實施方案中，其中存在取代和/或刪除的位置如下：位置220、275、356和 396〇
[0165] 在一個實施方案中，其中存在取代和/或刪除的位置如下：位置183、275、356、396 和 507。
[0166]在一個實施方案中，其中存在取代和/或刪除的位置如下：位置275、287、356、396 和 507。
[0167] 在一個實施方案中，其中存在取代和/或刪除的位置如下：位置275、356、396和 470 〇
[0168] 在一個實施方案中，其中存在取代和/或刪除的位置如下：位置275、356和507。
[0169] 在一個實施方案中，其中存在取代和/或刪除的位置如下：位置275、356和396。
[0170] 在一個實施方案中，其中存在取代和/或刪除的位置如下：位置275、287和356。
[0171] 在這些位置上優選的取代是如上所指的那些取代。
[0172] 可以用于根據本發明的方法中的依賴0HPS的甲硫氨酸合酶也是能通過刪除一個 或更多個對應SEQ ID No :3中顯示的氨基酸序列的氨基酸1至103的N-末端氨基酸，衍生 自任意上述依賴0HPS的甲硫氨酸合酶的酶。如在實施例中所示，上述依賴0HPS的甲硫氨酸 合酶的截短型式，例如其中與SEQ ID No: 3相比，31氨基酸殘基或103氨基酸殘基從N-末 端被刪除的截短型式，也還顯示有效的依賴0HPS的甲硫氨酸合酶的活性。
[0173] 在優選的實施方案中，根據本發明的依賴0HPS的甲硫氨酸合酶也顯示了將0-磷 酸-L-高絲氨酸和硫化物轉化為L-高絲氨酸和11 3?04的酶活性。優選地，硫化物是金屬硫 化物如Na2S。在此情況下，所述轉化根據以下反應方案進行：
[0174] 0-磷酸-L-高絲氨酸+Na2S〈 = >L-高半胱氨酸+H3P04
[0175] 將0-磷酸-L-高絲氨酸（0PHS)和金屬硫化物轉化為L-高絲氨酸和H 3P04的活性 可以在與上述基本相同的試驗中檢測，聯系將0-磷酸-L-高絲氨酸（0PHS)和甲硫醇轉化 為L-高絲氨酸和H 3P04的活性檢測。在此情況下，使用雙met2Amet25A酵母菌株并且所 述菌株在用Na 2S作為唯一硫酸鹽的來源的介質中生長。實際上，MET25編碼在酵母中唯一 已知活性的高半胱氨酸合酶，用硫化物催化〇-乙酰基-L-高絲氨酸的縮合。已經可以通過 使用被設計為除了雙met2met25突變，包括引發0-磷酸-L-高絲氨酸聚集的thr4突變的 釀酒酵母改進試驗的敏感性。
[0176] 此酶活性也可以進一步通過體外試驗確定，其中0-磷酸-L-高絲氨酸和Na 2S在 體外適宜的條件下用來自表達待測蛋白質的酵母菌株的非細胞提取物或用（部分）純化 的待測蛋白質培育并且其中通過比色法（Becker等，Journal of Biochemical Chemistry 244(1969)，2418)檢測高半胱氨酸的制備。
[0177] 本發明還涉及編碼根據本發明的蛋白質的核苷酸分子。所述核苷酸分子可以是 DNA或RNA，優選為DNA。
[0178] 此外，本發明涉及包括根據本發明的核酸分子的載體。在優選的實施方案中，載體 是允許表達根據本發明的核酸的載體從而允許根據本發明制備蛋白質。因此，在優選的實 施方案中，根據本發明的核酸可操作地與表達控制序列相關聯，表達控制序列允許在所期 望的宿主細胞或宿主細胞體系中表達。貫穿本說明書中使用的術語"操作性關聯"或"可操 作地關聯"，指一個或更多個表達控制序列之間的連接并且在核酸分子中的編碼區域待以 在與表達控制序列相適應的條件下實現的方式表達。
[0179] 表達包括異源DNA序列的轉錄，優選轉為可翻譯的mRNA。確保在植物細胞、動物細 胞和真菌以及細菌中表達的調控元素是本領域技術人員熟知的。其包括啟動子、增強子、終 止信號、靶信號等。下文結合有關于載體的詳細解釋進一步提供了實施例。
[0180] 用于與核酸分子相關聯的啟動子根據其來源和/或根據待表達的基因可以是同 源的或異源的。適宜的啟動子例如是將其本身提供在組成型表達中的啟動子。但是，也可 以使用僅通過外部影響確定的位置適時激活的啟動子。人造和/或化學誘導的啟動子可以 在此上下文中使用。
[0181] 可將根據本發明的載體引入（微）生物從而將其表達并導致能將0-磷酸-L-高 絲氨酸和甲硫醇轉化為L-甲硫氨酸的蛋白質的制備。
[0182]不同的表達體系的概述例如包含在Methods in Enzymology 153 (1987)， 385-516，在 Bitter 等（Methods in Enzymology 153 (1987)，516-544)和在 Sawers 等 (Applied Microbiology and Biotechnology 46(1996)，1-9)，Billman-Jacobe(Current Opinion in Biotechnology 7(1996)，500-4)， Hockney(Trends in Biotechnology 12(1994)，456_463)， Griffiths 等，（Methods in Molecular Biology 75(1997)， 427-440)。酵母表達體系的概述例如提供在Hensing等（Antonie van Leuwenhoek 67(1995)，261-279)， Bussineau 等(Developments in Biological Standardization 83(1994)，13-19)， Gellissen 等（Antonie van Leuwenhoek 62(1992)，79_93， Fleer (Current Opinion in Biotechnology 3(1992),486-496), Vedvick (Current Opinion in Biotechnology 2 (1991)，742-745)和 Buckholz(Bio/Technology 9(1991)， 1067-1072)。
[0183] 在文獻中已經廣泛描述了表達載體。作為規則，其不僅包含選擇標志基因和復制 源，確保在所選宿主中的復制，還包含細菌或病毒啟動子，以及在絕大多數情況下，用于轉 錄的終止信號。在啟動子和終止信號之間，通常存在至少一個限制位點或多聚連接子，其 實現編碼DNA序列的插入。如果其在所選的宿主生物體中是有活性的，可以使用天然控制 對應基因的轉錄的DNA序列作為啟動子序列。但是，也可以將此序列替換為其他啟動子序 列。有可能使用啟動子確保基因的組合型表達和誘導啟動子，其允許基因表達的計劃性控 制。細菌和病毒啟動子序列具有的這些性質在文獻中詳細描述。在文獻中充分描述了用于 在微生物（例如大腸桿菌、釀酒酵母）中表達的調節序列。允許特別高表達下游序列的啟 動子例如是 T7 啟動子（Studier 等，Methods in Enzymology 185 (1990)，60-89)、lacUV5、 trp、trp_lacUV5 (DeBoer 等，Rodriguez 和 Chamberlin(Eds)中，Promoters，Structure and Function ;Praeger，New York，（1982)，462-481 ;DeBoer 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983)，21-25)、lpl、rac (Boros 等，Gene 42 (1986)，97-100)。誘導性啟動子優選用于 合成多肽。這些啟動子通常造成比組成型啟動子更高的多肽產量。為了獲得最佳含量的多 肽，通常使用兩個階段的方法。首先，在最佳培養條件下培養宿主細胞至相對高的細胞密 度。在第二步驟中，取決于使用的啟動子類型誘導轉錄。為此目的，tac啟動子特別適合， 其可以通過乳糖或IPTG(=異丙基-0-D-硫代半乳糖苷）誘導（deBoer等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80(1983)，21-25)。在文獻中還描述了轉錄的終止信號。
[0184] 根據本發明的使用核苷或載體的宿主細胞的轉化可以通過如在Sambrook and Russell (2001)，Molecular Cloning ：A Laboratory Manual，CSH Press，Cold Spring Harbor，NY，USA ;Methods