完全培養基（-FBS，對照）的細胞相比，來自hUCESC的48小 時的CM通過基質膠基質顯著降低MDA-MB-231細胞的侵襲。B.與利用完全（+FBS)或不 完全（-FBS)培養基處理的細胞相比，在9天期間來自hUCESC培養的48小時的CM的給 予顯著降低了 MDA-MB-231細胞的三維生長。C. 13個SCID小鼠被注射在乳房脂肪墊中的 MDA-MB-231-Luc細胞。15天后，7只小鼠每五天瘤內注射150微升的來自hUCESC的條件 培養基（CM) (CM處理的）并且六只小鼠被注射不完全培養基（-FBS，對照）。在第15、20、 25、和30天拍攝對照和CM處理的小鼠的代表圖像。D.腫瘤體積通過測量發光來確定。值 表示為平均值土相對發光水平的標準偏差。**:P = 〇. 011與對照。E.利用CM和安慰劑 處理的SCID小鼠的代表性的腫瘤中的活化的半胱天冬酶-3表達的免疫組織化學檢測，如 (C)中所描述的。F.在CM處理的小鼠與對照小鼠中的總生存Kaplan-Meier曲線。與對照 小鼠相比，利用CM處理的小鼠具有長的DFS。差異是統計學顯著的（P = 0.019)。
[0131]圖10:來自具有高增殖率的乳腺腫瘤的原代培養的細胞增殖在給予來自hUCESC 的條件培養基（CM)之后顯著降低。A.來自人類乳腺腫瘤的10個原代培養利用以下來處 理：a)完全培養基（+FBS)，b)不完全培養基（-FBS)，c)由自身細胞在48小時期間生產的 條件培養基（CM)，d)由脂肪衍生的基質細胞（ASC)在48小時期間生產的CM，以及e)由 hUCESC在48小時期間生產的CM。在培養48小時后，進行MTT測定以評估細胞增殖。與其 他處理相比，具有高增殖率的培養（11B512，11B3285，11B3171和11B7352,紅色）在利用來 自hUCESC的CM處理后顯示出增殖的顯著（*#:P〈0. 001)減少。B.利用來自hUCESC的CM 或不完全媒介（-FBS)處理的來自具有高增殖率的原代培養的蛋白提取物利用細胞周期蛋 白D1，切割的PARP，和GAPDH(用作上樣對照）抗體孵育，并進行蛋白質印跡測定。
[0132] 圖11:在96微孔板中通過hUCESC條件培養基的病原微生物的生長抑制的代表性 實例。A.對照媒介（M)顯示大腸桿菌生長，并且hUCESC條件培養基（1)顯示出抑制細菌生 長到孔4 (1/20稀釋）。脂肪組織來源的MSC條件培養基的細菌生長在所有孔中。B.對于 每個狀態加入孔中的體積的表。圓圈指出顯示細菌生長抑制的孔。
[0133] 圖12:通過hUCESC的微生物的生長抑制的代表性實例。由CFU計數和0D分析的、 由hUCESC的微生物生長的有意義（p〈0. 001)的抑制。單獨的培養基和正常人成纖維細胞 (NHF)顯示出沒有抑制大腸桿菌生長。
[0134] 圖13:通過hUCESC條件培養基的微生物的生長抑制的代表性實例。由CFU計數 和0D分析的、由hUCESC條件培養基（CM)的微生物生長的有意義（p〈0.001)抑制。單獨的 培養基和正常人成纖維細胞條件培養基（CM NHF)顯示沒有抑制大腸桿菌生長。
[0135] 圖14:大鼠中的干眼癥模型。A.照片顯示出切除前的眶外淚腺。B.自適應希爾 默（schirmer)測試被用來測量淚液產生。C.在干眼癥眶外淚腺切除后7天，希爾默測試顯 示正常眼（NE)和干眼（DE)的結果。
[0136] 圖15 :"體內"上皮再生。A.剛剛在堿燒傷（TOh)后、15個小時后（T15h)和5天 后（Tf5D)的角膜熒光素染色的代表性圖像。B.堿燒傷后15小時上皮角膜再生的百分比的 統計分析（*P〈〇. 005)。C.堿燒傷后5天上皮角膜再生的百分比的統計分析（*p = 0. 005)。 使用的處理為條件培養基（CM)，在沒有與細胞的任何先前的接觸（M)情況下的培養基單 獨，具有透明質酸鈉的眼藥水（SH)和無處理（無治療，NoTreat)。
[0137]圖16:組織學。堿燒傷后5天（放大倍數，X10)來自利用條件培養基（CM)處理的， 在沒有與細胞的任何先前接觸（M)的情況下利用培養基單獨處理的，利用具有透明質酸鈉 的眼藥水（SH)處理的和無處理（NoTreat)的角膜的20 y載玻片的蘇木精伊紅染色的代表 圖像。
[0138] 圖17:抗炎作用。A-C.堿燒傷后5天的角膜的MCP-1 (A)，MIP_1 a⑶和TNF-a (C) 的實時PCR結果的統計分析。分析的條件是利用條件培養基（CM)處理的角膜；在沒有與細 胞的任何先前接觸（M)利用培養基單獨處理的角膜；利用具有透明質酸鈉的眼藥水（SH)處 理的角膜，來自干眼癥但沒有任何病變（NoUlc)的角膜，以及來自健康的眼睛且沒有任何 病變（正常）的角膜。 實施例
[0139] 實施例1:人子宮宮頸干細胞的分離和表征
[0140] I-材料和方法
[0141] 人子宮宮頸干細胞的分離和生長
[0142] 人子宮宮頸干細胞（hUCESC)在常規婦科檢查期間從宮頸的剝離獲得。簡單地說， 利用胰蛋白酶、膠原酶或可以分解宮頸粘液的其他酶來酶分解細胞學樣品。然后，將樣品在 400克離心5分鐘并將沉淀收集并接種在培養板上。孔可以預先用1%的明膠或纖連蛋白 或其他底物涂覆，以允許粘著。樣品在杜爾貝科改良的伊格爾（Eagle)培養基中培養：營養 混合物F-12 (DMEM-F12)，谷氨酰胺，有或沒有抗生素，具有血清，表皮生長因子（EGF)，氫化 可的松，胰島素，非必需氨基酸，丙酮酸鈉。細胞的傳代培養（繼代培養）利用胰蛋白酶或 Accutase或其他蛋白水解和/或膠原溶解酶來進行。
[0143] 流式細胞儀表征
[0144] 人子宮宮頸干細胞（hUCESC)利用特異性單克隆抗體的板進行染色：⑶29-PE、 CD45-FITC、 CD90-PE、 CD105-PE、 HLA-DR-PE(Beckman Coulter)、 CD44-PE、 CD73-PE、 CD31-PE、TRAl-81_FITC(Becton Dickinson, Biosciences Pharmingen)、CD34-FITC、 〇)117^^和〇)133^^(]\^1丨6町181〇丨6。）。7-氨基-放線菌素-0(7-440)(80?1^^11即611) 被加入用于死細胞的辨別。免疫分型是在等份分到不同的管中的相同的細胞上進行的。染 色的細胞重新懸浮在PBS中，并使用Cytomics FC500流式細胞儀（Beckman Coulter)進行 分析。使用由制造商提供的CXP軟件分析所計算的數據。
[0145] 免疫細胞化學表征
[0146] 如上所述培養人子宮宮頸干細胞（hUCESC)。3X 104個細胞接種在載玻片中，并且 在加工用于免疫細胞化學之前在96%的乙醇中固定10分鐘。小鼠腫瘤常規地在10%中性 福爾馬林緩沖液中浸沒固定24小時并包埋在石蠟中。
[0147] 4微米厚的切片被安裝在Flex IHC顯微鏡載玻片（Dako,格洛斯卓普，丹麥）。免 疫組織化學（IHC)技術在AutostainerLink 48(Dako)上自動進行。采用了對CK(克隆 AE1/AE3)，E-鈣粘著蛋白（克隆NCH-38)，波形蛋白（克隆V9)，結蛋白（克隆D33)，肌動蛋 白（克隆HHF35)，平滑肌肌動蛋白（克隆1A4)，和0連環蛋白（克隆連環蛋白-1)的 FLEX隨時可用的Dako初級抗體（一抗）。也使用了對來自Abeam (劍橋，英國）的p63 (克 隆4A4)的隨時可用的單克隆抗體。分別從Santa Cruz Biotechnology，Millipore，和 Sigma-Aldrich 獲得 KLF4、0CT4、和 Sox2 初級抗體（一抗）。表位檢索使用 EnVision FLEX 目標檢索溶液（pH為9)在微波中進行20分鐘。所有抗體在室溫孵育20分鐘，除孵育30 分鐘的P63之外。作為檢測系統，使用了 EnVision FLEX/HRP Dako(葡聚糖聚合物，其結合 有辣根過氧化物酶和親和分離的山羊抗小鼠和抗兔免疫球蛋白）20分鐘。對于E-鈣粘著 蛋白，加入小鼠連接物（Dako)。
[0148] 生長率
[0149] hUCESC的增殖率通過每天計數復孔中的細胞總數12天來測定。最初，細胞以 2, 000個細胞/孔接種在6孔培養板中。
[0150] 球體形成和脂肪分化
[0151] hUCESC 在 DMEM/F12 培養基（體積 / 體積）（Invitrogen)、1 % B27 (Invitrogen)、 10ng/mL的表皮生長因子（EGF)和5ng/mL的成纖維細胞生長因子-2 (FGF-2)、100IU/mL青 霉素和100 y g/mL的鏈霉素中在60mm培養皿中培養，并且在5-7天后對球體拍照。為了 誘導脂肪分化，hUCESC在hMSC分化Bulletkit-脂肪生成培養基（hMSC Differentiation Bulletkit-Adipogenic medium) (Lonza Biologies, Walkersville，美國）中在 60mm 的培 養皿中培養12天，然后甲醛固定用于油紅0染色（Sigma)。
[0152] 條件培養基生產
[0153] 細胞以3X104細胞/cm2的密度在具有10%FBS和抗生素的DMEM:F12培養基中鋪 板。48小時后，用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS)將細胞洗滌3次，并且然后在沒有FBS的DMEM:F12 中培養24小時或48小時。然后，將培養基收集作為條件培養基（CM)，以300g離心10分鐘 并立即使用或保存在-20°C。
[0154] II-結果
[0155] 使用免疫細胞化學和流式細胞儀檢查由宮頸的剝離獲得的人子宮宮頸干細胞 (hUCESC)的免疫表型。如圖1A所示，利用0連環蛋白，和波形蛋白抗體對hUCESC進行陽 性免疫標記，并且一些彌漫性局灶性細胞對于泛細胞角蛋白抗體也是陽性的。此外，hUCESC 具有胚胎干細胞的三種轉錄因子特征的強表達，即0CT4、KLF4和Sox2 (圖1B)。hUCESC表 型還通過流式細胞儀確定。我們發現，這些細胞對于⑶29、⑶44、⑶73、和⑶90是陽性的， 而他們對于CD34、CD45、CD133 (造血標志物）、CD117、CD31、TRA-1-81 (胚胎干細胞表面標 記物）、和HLA-DR是陰性的（圖1C)。
[0156] 為了進一步評價hUCESC細胞的特征，它們被誘導以形成球體。在培養七天后，各 細胞在無血清的條件培養基中保持懸浮培養。七天后，細胞形成克隆球狀體結構（圖1D)。
[0157] 另外，hUCESC的增殖率通過每天計數復孔中的細胞總數12天來確定。hUCESC以 每24小時0. 4-2. 1倍增的速率增殖（圖2)。
[0158] 實施例2:炎癥相關的實驗
[0159] I-材料和方法
[0160] 免疫原性測定（分析）
[0161] 單向混合淋巴細胞反應（MLR)測定用于確定人子宮宮頸干細胞（hUCESC)的免疫 原性。MLR使用沒有FBS的RPMI 1640培養基在96孔微量滴定板中進行。來源于兩個不同 供體的外周血單核細胞（PBMC)以每個供體每孔2X105個細胞被鋪板。不同供體被用來最 大化如下機會：PBMC中的至少一個是與hUCESC測試細胞的重大失配。在測定中使用的刺激 細胞包括自體PBMC (基線響應）、異源PBMC (陽性對照反應）、和hUCESC細胞群。刺激細胞 在被添加到培養孔中（每孔2X104個細胞，10%刺激細胞）之前用絲裂霉素C處理。額外 的對照培養由鋪板在單獨的培養基（沒有刺激細胞）中的PBMC、刀豆蛋白A(ConA)刺激的 PBMC和絲裂霉素C單獨處理的hUCESC組成。對各處理進行一式三份培養。增殖由細胞增 殖試劑WST-1 (羅氏應用生物科學（Roche applied bioscience))評估。活（代謝活性）細 胞將四唑鑰鹽還原成有色甲臜（formazan)化合物；死的細胞則不會。因此，基于四唑鑰鹽 的比色法排他性地檢測活細胞。樣品的吸光度相對作為空白的背景對照使用微量滴定板讀 數器測量。用于測量甲臜產物的吸光度的波長在420-480nm之間（最大吸收在約440nm)。 參考波長應當大于600nm。
[0162] 單核細胞分化的抑制
[0163] U937細胞系用于該試驗。細胞在具有10 % FBS和抗生素的DMEM: F12中以1. 5 X 105 個細胞/孔的密度在24孔板中鋪板。加入2ng/mL的佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯 (PMA)，PMA處理，其激活蛋白激酶C，在U937細胞中誘導更大程度的分化，如通過增加的 粘著和與巨噬細胞分化相關的表面標記物的表達所反映的。在對照孔中，沒有加入PMA溶 液。24小時后，培養基更換為來自hUCESC或來自人脂肪源性干細胞（ASC，StemPro?， Invitrogen)的條件培養基，在測試孔中再培養24小時。額外測試包括在條件培養基的存 在下用PMA刺激U937細胞系。收集上清液，并對貼壁細胞洗滌，胰蛋白酶處理并收集在相 應的管中。將細胞以200g離心5分鐘，并再懸浮在100 y 1的PBS中。巨噬細胞的分化通 過流式細胞儀分析通過單核細胞分化標記物⑶lib的表達來監測。細胞用PE-⑶lib單克 隆抗體并用7-AAD染色以評估細胞活力。Mac-1 (CD1 lb)抗原最初被描述為用于巨噬細胞的 細胞表面標記物。Mac-1抗原介導涂覆有C3bl的粒子的通過粒細胞和巨噬細胞的附著和吞 噬作用。此外，Mac-1顯示出介導各種粘附依賴性功能，包括粒細胞趨化性，粘附到表面和 聚集。
[0164] 利用條件培養基抑制PBMC增殖
[0165] 來自健康志愿者的外周血單核細胞（PBMC)通過Histopaque-1077 (Sigma)密度梯 度離心從20毫升肝素化的外周血中分離。從界面回收的細胞用PBS洗滌兩次，并再懸浮于 補充的RPMI 1640中。PBMC的生存力通過臺盼藍排除法測定。分離的PBMC的等分試樣被 冷凍，并儲存在-80°直至進一步使用。對于實驗，PBMC的冷凍等分隨機選自8名無關的供 者，解凍并使用。
[0166] 對于測定的PBMC增殖，分離的PBMC在無FBS的DMEM:F12中在96孔平底微量滴 定板中使用條件培養基（來自hUCESC或ASC)培養4天（2 X 105個細胞/孔），并用1 y g/ mL的刀豆蛋白A(ConA)刺激。PBMC單獨和具有10 6M地塞米松的ConA刺激的PBMC分別用 作基礎增殖對照和抑制對照。增殖通過細胞增殖試劑WST-1評估。這種測定排他性地檢測 活細胞。樣品的吸光度相對作為空白的背景對照使用微量滴定板讀數器測量。
[0167] II-結果
[0168] 執行單向MLR測定來評估hUCESC的免疫原性。PBMC的增殖在絲裂霉素C處理的 刺激細胞的存在下基于代謝活性的活細胞的增加的數量來測定。自體和異體PBMC分別用 作陰性和陽性刺激細胞對照。ConA刺激的PBMC用作其他陽性刺激對照細胞。如圖3所示， hUCESC在MLR測定中不誘導T細胞增殖。
[0169] 此外，巨噬細胞的分化通過流式細胞儀分析由單核細胞分化標記物CDllb的表達 監測。在圖4中，它顯示出在存在hUCESC條件培養基的情況下利用刺激來抑制單核細胞分 化。U937⑶lib表達的基礎水平為34%，并且與PMA處理的對照U937細胞相比，對于⑶lib 染色陽性的細胞百分比從PMA處理的U937細胞中的73 %下降到hUCESC條件培養基處理 的U937細胞中的48%。對于利用ASC條件培養基處理的U937細胞⑶lib表達的百分比是 67%。值得注意的是，U937細胞的生存力在所有條件下高于80%。這些數據表明在hUCESC 條件培養基的存在下單核細胞分化的抑制或保護。在圖5中，示出了單核細胞分化的抑制： 刺激24小時并加入hUCESC條件培養基。U937⑶lib表達的基礎水平是38%，并且與PMA 處理的對照U937細胞相比，對于⑶lib染色陽性的細胞百分比從PMA處理的U937細胞中 的82%下降到利用在24小時期間（CM 24小時）生產的hUCESC條件培養基處理的U937細 胞中的48%，以及下降到利用在48小時期間（CM 48小時）生產的條件培養基處理的U937 細胞中的34%。然而，在ASC(CM 48小時）處理的U937細胞中的⑶lib表達為77%。值 得注意的是，U937細胞的生存力在所有條件下高于80%。這些數據表明，在hUCESC條件培 養基的存在下單核細胞分化的抑制，并且在條件培養基48小時情況下，CDllb陽性細胞的 百分比與U937基礎水平的百分比明顯相同。
[0170] 在圖6中，示出了利用條件培養基抑制PBMC增殖。兩種hUCESC條件培養基，24小 時和48小時，抑制了 PBMC的增殖。與ASC條件培養基相比，利用hUCESC條件培養基的抑 制是更有效的。通過hUCESC條件培養基的抑制幅度超過了地塞米松的抑制幅度。地塞米 松是更有效的抗炎藥物，這些數據表明hUCESC條件培養基的高的抗炎潛力。
[0171] 實施例3:癌癥相關的實驗
[0172] I.-材料和方法
[0173] 細胞培養
[0174] MCF-7和MDA-MB-231細胞（人乳腺癌細胞系）從歐洲細胞培養物收集中心（索爾 茲伯里（Salisbury)，Wilts.，英國）獲得，并且HT29(結腸直腸腺癌細胞系）和AGS (胃腺 癌細胞系）從美國典型培養物保藏中心（ATCC，馬納薩斯，弗吉尼亞州，美國）獲得。這些細 胞系在空氣-C0 2(95:5)的氣氛中在37°C下在90毫米的培養皿中在補充有10% FBS、100U/ mL青霉素和100 y g/mL鏈霉素的DMEM中生長。匯合的細胞用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌兩次，并 且通過在PBS中用胰蛋白酶-EDTA溶液（Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，M0,美國）簡單孵 育而收獲。人宮頸癌子宮干細胞（hUCESC，如上所述獲得）、來自人類乳腺腫瘤的原代培養 物、和人體脂肪來源的干細胞（ASC，StemPro?，Invitrogen)在空氣-C0 2(95:5)的氣氛中 在37°C下在90毫米的培養皿中在補充有10% FBS、100U/mL青霉素和100yg/mL鏈霉素的 DMEM-F12(1:1)中生長。
[0175