]來自 hUCESC、ASC、MCF-7 和 MDA-MB-231 的條件培養基（CM)通過在 DMEM-F12(10% FBS)中將細胞培養至70%匯合而獲得。然后，在PBS中洗滌細胞3次，并且在沒有FBS的 情況下，在DMEM-F12中再次培養。在24或48小時后，將培養基以300g離心10分鐘，收集 上清液，并且立即使用。
[0176] 進行三維細胞培養。簡言之，將培養載玻片涂覆有60yL的冰冷基質膠（BD Biosciences)，并且在37°C下孵育20分鐘，以使基質膠固化。用0. 25%胰蛋白酶-EDTA溶 液（2. 5g/L的胰蛋白酶、0. 38g/L的EDTA) (Invitrogen)處理細胞5分鐘。補充有2% (vol/ vol)的基質膠且每100 y L體積的培養基含有5 X 103個細胞的單細胞懸浮液被小心地放置 在固化基質膠的頂部上。孵育在37°C下進行30分鐘，以允許細胞附著至基質膠。培養載玻 片然后放置在6孔板中，每孔加入500 y L的培養基，并將細胞培養10天。hUCESC然后用 不同培養基（具有 10%FBS(+FBS)的 DMEM-F12、無 FBS(-FBS)的 DMEM-F12,或來自 hUCESC 的48小時的條件培養基）處理1周。用奧林巴斯DP72相機拍攝作為單層的或在三維培養 物中的細胞的相襯照片。通過跟蹤穿過球體的直徑的直線并且將其數值以任意長度單位計 量來手動執行球體直徑的定量。
[0177] 共培養
[0178] 如上所述地培養細胞。以70%匯合而除去培養基，并且按照生產商的說明，用預熱 的 CellTracker?溶液（具有 CellTracker ?綠色 CMFDA 的 MCF-7 和 MDA-MB-231 以及具有 CellTracker?紅色 CMPTX 的 hUCESC ;Invitrogen，Eugene，美國）標記細胞。然后，IX 10 5 個MCF-7或MDA-MB-231細胞/孔被鋪展在6孔板上，并且4小時后，1 X 105個hUCESC細胞 被加入到MCF-7或MDA-MB-231細胞中，并被共培養72小時。圖像是利用高分辨率的數碼 相機（奧林巴斯DP 72 ;奧林巴斯公司，東京，日本）在12、48和72小時隨機拍攝的。計數 幀（102 ym2)被重疊在拍攝圖像上，并且，只有清楚可見的細胞在顯微照片的至少三個不同 的區域使用ImageJ軟件（美國國立衛生研究院（National Institute of Health)，貝塞斯 達，馬里蘭州，美國）被計數。
[0179] 結腸直腸癌和胃腺癌細胞系增殖
[0180] 使用細胞增殖試劑WST-1 (Roche)來評估HT29和AGS增殖。HT29和AGS細胞系 以每孔2X 104個細胞被鋪展在96孔平底微量滴定組織培養板中。24小時后，使用等體積 (150 y L)的具有 10 % FBS 的 DMEM-F12 (對照）、無血清（w/o, FBS)的 DMEM-F12、和來自 hUCESC的24或48小時的條件培養基、在24或48小時期間的ASC來處理細胞。WST-1試 劑（15 yL)被加入到每個孔中，并將該混合物溫育1小時。吸光度（440nm)是使用微量滴 定板讀數器針對作為空白的背景對照來測量的。
[0181] MTT 代謝
[0182] 使用3_(4, 5-二甲基噻唑-2-基）_2, 5-二苯基四唑溴化物（MTT)測定進行細胞 生存力/增殖實驗。MCF-7、MDA-MB-231、或來自人類乳腺腫瘤的初級培養物以每孔3 X 104 個細胞被鋪展在24孔板中。24小時后，使用等體積（500 yL)的具有10% FBS(+FBS)的 DMEM-F12,無 FBS(-FBS)的 DMEM-F12,和來自 MCF-7、MDA-MB-231、hUCESC、ASC 的 24 或 48小時的條件培養基，或24小時或48小時期間的乳腺癌腫瘤的原代培養物來處理細胞。 MTT (0. 5 y g/y L)被加入到各孔中，并將該混合物溫育1小時。然后將培養基除去，并且將 DMSO(500 yL)加入到各孔中。在多孔板讀數器（Tecan ULTRA Evolution，M丨ilinedorf，瑞 士）上在570nm處測量樣品的吸光度。結果繪制為來自至少兩個獨立實驗的一式四份的平 均值土 SD值。
[0183] 蛋白質印跡分析
[0184] MCF-7、MDA-MB-231細胞、和來自人乳腺腫瘤的原代培養物在4°C下在300 y L的裂 解緩沖液（50mM HEPES，pH 7. 5 ;150mM 的 NaCl ;5mM 的 EGTA ;1. 5mM 的 MgCl2;l% SDS ;10% 甘油，1 %的Triton X-100 ;10mM的原釩酸鈉；4mM的PMSF，和50 y g/mL的抑肽酶）中裂 解。然后，在4°C下，將細胞裂解物以14, OOOxg離心5分鐘，收集所得到的上清液，并且通過 Bradford方法測定蛋白質濃度。進行蛋白質印跡。簡言之，對60 yg的總蛋白質進行SDS PAGE電泳。將蛋白質轉移到硝酸纖維素膜，阻斷，并且在4°C下用初級抗體（一抗）進行免 疫標記過夜（見表1)，用PBS-吐溫-20洗滌三次，并用適當的二級抗體（二抗）孵育1小 時。利用皮爾斯ECL蛋白質印跡底物（Thermo Scientific，羅克福德，IL，USA)檢測信號， 并按照制造商的說明通過將印跡與標準X射線膠片接觸來可視化。
[0185] 表1:初級抗體
[0186]
[0187]
[0188] ICC:免疫細胞化學；IHC:免疫組織化學；WB:蛋白質印跡
[0189] 細胞周期和凋亡測定
[0190] 通過使用Guava流式細胞儀（Millipore公司，比爾里卡，MA，USA)進行了細胞周 期和凋亡測定。簡言之，將2X105個細胞/孔在a)補充有10%FBS的DMEM-F12(1:1);b) 沒有FBS的DMEM-F12 (1:1);和c)在48小時期間的條件培養基中培養，收獲，用70%冷乙 醇固定30分鐘，用PBS洗滌，并用核糖核酸酶（100 y g/mL)和碘化丙啶（PI，50 y g/mL)在黑 暗中孵育30分鐘，用于細胞周期評估。使用膜聯蛋白V-FITC進行凋亡分析。收獲細胞，用 PBS洗滌兩次，并重新懸浮在IX結合緩沖液（0? 1MIfepes (pH7. 4)，1.4M的NaCl和25mM的 CaCl2)中。加入5yl的FITC膜聯蛋白V，并在室溫下在黑暗中孵育15分鐘。最后，400yL 的IX結合緩沖液加入到每個管中，并進行分析。膜聯蛋白V陽性和PI陰性表明早期凋亡， 同時膜聯蛋白V陰性和PI陽性表明晚期凋亡。
[0191] 細胞侵襲測定
[0192] 根據制造商的說明（BD Biosciences)，在BD BioCoatMatrigel侵襲室內進行測 定。被預涂覆有基質膠的過濾器用于檢查細胞侵襲。MDA-MB-231細胞被置于上腔室中，在 0. 5mL的DMEM無血清培養基中（每個過濾器5 X 104個細胞）。來自48小時培養的hUCESC 的條件培養基被放置在下腔室中，作為20% FBS。孵育22小時后，在室溫下，已經迀移到過 濾器的下表面的細胞被固定在甲醇中2分鐘，使用結晶紫染色2分鐘，被可視化并計數。細 胞迀移或侵襲的數值被表示為每個過濾器的四個區域中的每個顯微鏡區域的平均細胞數， 用于重復實驗。實驗重復三次。
[0193] 動物研究
[0194] 對于嚴重聯合免疫缺陷自發突變（CB17-Prkdcseld，命名為SCID，Parc Recerca Biomedica，巴塞羅那，西班牙）同型結合的、年齡匹配在6-8周之間的雌性小鼠被用于異種 移植研究。十三只SCID小鼠（6只對照和7只治療的）利用3X 106個MDA-MB-231細胞被 皮下注射到左和右側腹中，該細胞被穩定轉染有pcDNA3-熒光素酶載體（MDA-MB-231-Luc 細胞）。在細胞注射15天后，小鼠每五天被腫瘤內注射（150 y L)有來自hUCESC的48小時 條件培養基（CM)或安慰劑，直到第47天。在熒光素注射（150mg/kg)后，使用體內成像系 統（IVIS，Caliper Life Sciences，Alameda，CA，USA)，通過發光從外部監視腫瘤的生長。 使用生活圖像軟件（Caliper Life Sciences)獲得強度圖。該軟件使用基于顏色的尺度來 表示每個像素的強度（范圍從代表低的藍色到代表高的紅色）。一個對照和一個CM處理的 小鼠在第31天被處死并切除腫瘤，固定在10%中性福爾馬林緩沖液中24小時，并且包埋在 石蠟中，用于組織學和免疫組織化學研究。所有剩余的小鼠被監測用于生存分析。
[0195] 免疫組織化學
[0196] 小鼠腫瘤被浸沒固定在10%中性福爾馬林緩沖液24小時，并且常規地包埋在石 蠟中。4ym厚的切片被安裝在Flex IHC顯微鏡載玻片（Dak〇，Gl〇strup，丹麥）上。在 AutostainerLink 48(Dako)上自動進行免疫組織化學（IHC)技術。使用活化的半胱天冬酶 3抗體（細胞信號）被。使用EnVision FLEX目標檢索溶液（pH為9)，在微波中進行表位 檢索20分鐘。所有抗體在室溫（RT)下孵育20分鐘。作為檢測系統，我們使用了 EnVision FLEX/HRP Dako (葡聚糖聚合物，其結合有辣根過氧化物酶和親和分離的山羊抗小鼠和抗兔 免疫球蛋白）20分鐘。
[0197] II-結果
[0198] hUCESC對人體癌細胞增殖的作用
[0199] 為了探討hUCESC對癌細胞系的可能影響，在48小時期間針對結腸直腸（HT29)和 胃（AGS)腺癌細胞系而評估了細胞增殖測定，所述細胞系利用完全培養基（對照）、不完整 培養基（w/o FBS)、在24小時或48小時期間產生的來自hUCESC的條件培養基、在48小時 期間產生的來自ASC的條件介質進行處理。與來自ASC的條件培養基相比，hUCESC條件培 養基對結腸直腸和胃腺癌細胞增殖的作用是更有效的（圖7A)。
[0200] 為了探討在給予來自hUCESC的條件培養基（CM)后hUCESC對乳腺癌的可能效果， 對于在非侵入性人乳腺癌細胞系MCF-7中和在高度侵入性人乳腺癌細胞系MDA-MB-231中 的增殖/細胞毒性進行了評估。如圖7B-C所示，在將來自hUCESC的CM給予MCF-7細胞 的24和48小時之后（24或48小時），與利用沒有FBS的培養基處理的細胞或通過MCF-7 細胞在24或48小時生產的CM相比，沒有觀察到MTT代謝的顯著減少。然而，當將來自 hUCESC的相同CM給予MDA-MB-231細胞系時，在24小時（來自48小時期間培養的hUCESC 的CM，P〈0. 01)和48小時（來自24和48小時期間培養的hUCESC的CM，分別地，P〈0. 01和 P〈0. 001)，觀察到細胞增殖的顯著降低（圖7D-E)。為了評估來自hUCESC的CM對細胞增殖 的效果是否可以通過利用MCF-7或MDA-MB-231細胞進行的hUCESC的共培養來維持，或者 僅僅依賴于CM，用綠色染料來標記MCF-7和MDA-MB-231，并且用紅色染料來標記hUCESC。 據發現，雖然利用hUCESC共培養的MCF-7細胞成長為單獨培養的MCF-7 (圖7F)，但是與單 獨的MDA-MB-231細胞的生長相比，利用hUCESC共培養MDA-MB-231細胞顯著（P〈0. 01)減 少了 MDA-MB-231細胞的數目（圖7G)。
[0201] 來自hUCESC的條件培養基延緩細胞周期并誘導MDA-MB-231細胞系中的細胞凋亡
[0202] 鑒于來自hUCESC的CM顯著減少MDA-MB-231細胞的增殖，評估了作為這種疾病 的可能介質的細胞周期和細胞凋亡。在48小時期間，用DMEM加10% FBS(+FBS)、沒有 FBS (-FBS)的DMEM、或來自hUCESC的48小時的CM對MDA-MB-231細胞進行培養，然后我們 使用碘化丙啶（PI)執行流式細胞術（以評估細胞周期），和膜聯蛋白V/PI以評估細胞凋 亡。此外，進行蛋白質印跡，以評估參與了細胞周期和凋亡兩者的蛋白的表達。結果表明， 相對于利用完全（+FBS)或不完全（-FBS)培養基處理的細胞，CM-處理的細胞顯著增加了 G0-G1期（圖8A)。因此，在CM處理的細胞中觀察到在細胞周期蛋白A、細胞周期蛋白B和 細胞周期蛋白D1蛋白表達中的可見疾病（圖8B)。利用CM對MDA-MB-231細胞的處理誘導 了膜聯蛋白+/PI-和膜聯蛋白+/PI+細胞相對于沒有FBS培養的細胞的顯著增加，這提示， CM分別誘導了早期和晚期凋亡（圖8C)。來自利用CM處理的MDA-MB-231細胞的蛋白質提 取物的免疫印跡示出了相對于利用完全（+FBS)和不完全（-FBS)培養基治療的細胞，半胱 天冬酶-8, -12, -9、活化的半胱天冬酶-3和切割的PARP的明顯增加（圖8D)，以及Bid和 Bim的減少（圖8E)。
[0203] 通過來自hUCESC的條件培養基來改變侵襲、三維培養物的形成、腫瘤生長和存活 率
[0204] 探索了，來自hUCESC的CM是否通過基底膜基質而影響MDA-MB-231細胞的侵襲。 圖9A示出了與在不完全培養基（-FBS)的存在下的細胞相比較，在CM的存在下MDA-MB-231 細胞的侵襲能力顯著（P〈〇. 001)減少。也探討了 MDA-MB-231細胞的三維生長。對于這些 實驗，在基質膠中培養MDA-MB-231細胞，所述基質膠是一種細胞在其中形成球形結構的半 固體介質。利用CM的處理顯示了這些球體的直徑的顯著降低，當利用不完全培養基（CM，平 均直徑=2. 8±1.0vs-FBS，平均直徑=5. 7±1.6,任意單位，P = 0. 023)處理細胞時，這是 不合適的（圖9B)。
[0205] 接著評估了在體內使用嚴重免疫缺陷（SCID)小鼠腫瘤異種移植模型的CM瘤內給 藥的影響。小鼠在乳腺脂肪墊中被注射有MDA-MB-231細胞（其穩定轉染了熒光素酶載體） 并且15天后，當腫瘤變得可見時，它們每五天用不完全培養基（對照）或用來自hUCESC的 CM(150 yL)進行瘤內注射，并且通過發光進行外部監視（圖9C)。在利用CM處理15天后 (在第30天）觀察到腫瘤體積的顯著減少（P = 0.011)(圖9D)。在第33天，兩只動物（一 個對照和一個CM處理的小鼠）被處死，腫瘤被去除，并通過免疫組織化學針對活化的半胱 天冬酶-3 (作為細胞凋亡的指標）進行分析。圖9E示出了 CM處理的小鼠中的活化的半胱 天冬酶-3表達的顯著增加。為了評估小鼠的存活率，剩余小鼠每5天被注射CM或安慰劑， 并觀察直到47天。如圖9F所示，Kaplan-Meier生存曲線表明，與對照組相比，利用CM處 理的小鼠具有較長的總生存率（P = 0. 019)。
[0206] 條件培養基降低了具有高增值率的腫瘤的增殖
[0207] 下面評估了在來自患有乳腺腫瘤的患者的原代培養物中給予來自hUCESC的CM 的影響。因此，使用MTT測定，評估了十個乳腺癌初級培養物的細胞增殖。然而，與由不完 全培養基（-FBS)、來自自身的CM、或由來自具有更高增殖率的乳腺腫瘤（11B512，11B3285， 11B3171和11B7352)的初級培養物中的脂肪衍生的基質細胞（ASCc)產生的CM產生的效 果相比，在具有低增殖率的乳腺腫瘤細胞中（11B3186,11B2445,11B530,11B545,11B980和 11B2127)，來自hUCESC的CM的給予對細胞增殖沒有顯著影響，與其他治療（圖10A)相比， 來自hUCESC的CM的給予誘導了細胞增殖的顯著（P〈0. 001)減少。也評估了來自具有更高 增殖率的這些原發性腫瘤的蛋白質提取物中的細胞周期蛋白D1和切割的PARP表達。結果 示于圖10B中。當給予來自hUCESC的CM時，觀察到細胞周期蛋白D1和PARP切割的表達 的顯著減少，但在利用不完全培養基（無FBS)處理的原代培養物中則沒有觀察到。
[0208] 實施例4:通過hUCESC的病原微生物的生長抑制
[0209] I-材料和方法
[0210] 使用的細菌菌株是：大腸桿菌（ATCC25992)、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus) (ATCC29213)、和奠腸球菌（Enterococcus faecalis)(ATCC51299)〇
[0211] 在多孔板中的通過連續稀釋進行的生長抑制
[0212] 在96微孔板培養物中評估了病原微生物的生長抑制，以確定具有抗微生物活性 的培養基的最大稀釋。簡言之，將對照（沒有FBS的DMEM-F12培養基）和條件培養基 (hUCESC或脂肪組織來源的MSC)的100 y L的系列1:2稀釋液和75 y L的系列1:2稀釋液 置于96孔板中。然后，將腦心肉湯（brain heart broth) (1:300稀釋的0. 5麥法蘭懸浮液 (McFarland suspension))的細菌懸浮液加入到每個孔中。該板在37°下培育24至48小 時。細菌生長抑制通過將對照孔與含有hUCESC或脂肪組織來源的MSC條件培養基的孔進 行比較來確定。
[0213] 通過hUCESC及其條件培養基的細菌生長的抑制
[0214] 對于每個實驗的大腸桿菌（大腸桿菌，ATCC 25992)的菌落從冷凍儲存中接種， 并通過輕微攪動在37°C下在液體的Luria-Bertani(LB)培養基（Difco BD，USA)中過夜 生長。每次實驗前，細菌細胞被洗滌一次并再懸浮在PBS中，并且測量懸浮液的光學密度 (入=600nm處的0D)。CFU的數目根據以下公式計算：對于大腸桿菌，0D_= 1.0對應于 4 X10sCFU/ml。通過hUCESC或其條件培養基（CM)的細菌生長的直接抑制的評估通過計數 CFU和讀取0D來完成。
[0215] 簡言之，在24孔板中，300CFU大腸桿菌被加入到：1)補充有10% FBS的DMEM/ F-12-HAM(1:1)中的2X105hUCESC ;2)在相同培養基中的2X105個正常人體纖維細胞 (NHF);和c)單獨的培養基。然后，將培養物在潮濕的C02培養箱中溫育6小時。在LB中， 在37°C下，在2小時后在成長感染的培養物中測量光密度。在37°C的過夜溫育后，在L