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[0159] 膀胱癌和腦膠質母細胞瘤中高發的TERT啟動子突變
[0160]端粒酶逆轉錄酶(TERT)活動頻繁上調人類癌癥，這被認為是促進人類腫瘤的重要 機制。在這里，我們對TERT啟動子突變-1，295，228 OT和1，295，250 OT(分別被稱為C228T 和C250T，下同）在膀胱癌和膠質母細胞瘤進行了研究。結果總結在表5和圖2中。
[0161] 使用主膀胱癌和腦膠質母細胞瘤組織是根據機構道德審查委員會批準的協議。月中 瘤組織的基因組DNA分離是用蛋白酶K消化，酚-氯仿提取和乙醇沉淀的標準方法獲得的。 TERT啟動子的片段通過聚合酶鏈式反應(PCR)使用引物擴增5 ' -AGTGGATTCGCGGGCACAGA-3 ' (SEQ ID N0:2)(正向）和5'-CAGCGCTGCCTGAAACTC-3'（SEQ ID N0:3)(反向），所產生的PCR 產物含235堿基對，其中載有C228T和C250T突變的位點。
[0162] 擴增PCR用如下條件，起始變性一不用95°C，進行3分鐘；隨后10個循環的95°C30 秒，55°C30秒，和68°C 1分鐘。隨后有30個類似循環，只是合成延伸一不增加5秒。PCR產物的 質量通過凝膠電泳證實。測序PCR用Big Dye終止v3.1循環測序反應試劑盒（Applied Biosystems公司）和ABI PRISM 3730自動下一代遺傳分析儀(Applied Biosystems)測序完 成。突變陽性例通過重復擴增PCR和同時使用反向引物測序予以證實。
[0163] 如表5中所總結的，我們發現，TERT啟動子突變C228T和C250T在膀胱癌，膀胱癌的 細胞系，和腦膠質細胞瘤中甚為常見。在所有情況下C228T都遠比C250T更常見。具體來說， 我們發現C228T存在于81 % (42/52)的膀胱癌樣本中，而C250T存在于4% (2/52)樣本中。這 兩個突變在膀胱癌中是相互排斥，二者總和的發生率為85% (44/52) X228T突變在膀胱癌 細胞系中為88 % (7/8)，在這些細胞系中，我們沒有檢測到C250T突變。在對膠質母細胞瘤 的TERT啟動子突變研究中，我們發現C228T突變率為65% (48/74)，而C250T的突變率為19% (14/74)。這兩個突變膠質母細胞瘤也相互排斥，二者總和發生率是84% (62/74)。
[0164] 本研究通過對大量病例的檢測分析，研究提示TERT啟動子突變在膀胱癌中的高發 生率，這些突變在膀胱癌中屢見不鮮。一個85%的體細胞基因突變發生率是非常高的，這在 任何人類癌癥中都會是如此。我們還發現，TERT啟動子突變發病率在膠質母細胞瘤中也非 常高，這就像TERT啟動子突變在膀胱癌的高發生率一樣，這在任何人類癌癥的體細胞突變 中也都算是很高的。我們對TERT啟動子突變在膀胱癌和膠質母細胞瘤的高發生率的發現， 說明這種遺傳改變對兩種癌癥的發病都是重要機制。由于發生率很高，TERT啟動子突變為 膀胱癌和成膠質細胞瘤的診斷測試預期將具有高的靈敏度。由于些突變只發生在癌腫瘤 中，TERT啟動子突變的測試對膀胱癌和膠質細胞瘤也會是很特異的。C228T和C250T突變都 形成一個11堿基的核苷酸拉伸5'-CCCCTTCCGGG-3'（SEQ ID NO: 1)，其中包含一個共識結合 位點，GGAA(反向互補鏈），是ETS轉錄因子在DNA上的結合點。這賦予這些突變以強大的生物 功能；可以預計這些TERT啟動子突變會導致TERT在膀胱癌和膠質細胞瘤里表達的上調，機 制是通過ETS轉錄因子的作用。的確，有研究證明這兩個突變賦予TERT啟動子增加的轉錄活 性。因此，這些TERT的突變可以是膀胱癌和膠質細胞瘤新的風險評估和預后因素及新治療 靶向目標。因此，這些TERT啟動子突變的發現對膀胱癌和膠質母細胞瘤新的診斷，預后和治 療策略的建立有重要的臨床意義。對其他含有TERT啟動子突變的癌癥也有同樣的指導意義 (表6)。膀胱癌和膠質母細胞瘤TERT啟動子突變的研究結果總結在表5和圖2。
[0165] 表5膀胱癌和膠質母細胞瘤TERT啟動子突變的研究結果總結
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[0173] 其它癌癥中的TERT啟動子突變
[0174] 如表6所示，除了膀胱癌和腦瘤(成膠質細胞瘤），我們發現其它一些人類癌癥也有 TERT啟動子突變，這可以幫助開發在這些人類癌中新的診斷，預后和治療策略。
[0175] 表6其它人類癌癥中TERT啟動子的突變
【主權項】
1. 一個用于處理甲狀腺癌患者的方法，包括以下步驟： 1) 從所述受試患者獲得生物樣品； 2) 用從受試者所獲得的樣品做測定，檢測1,295,228C>T(C228T)和1,295,250OT (C250T)兩個端粒酶逆轉錄酶(TERT)基因的啟動子突變，其分別對應于從TERT基因啟動子 的翻譯起始位點起的-124C>T和-146C>T; 3) 如果C228T和/或C250T突變被鑒定為陽性（即存在），則可確定該患者的甲狀腺癌有 高侵襲性或會發展成高侵襲性;那么， 4) 選擇適合于有高侵襲性或會發展成高侵襲性甲狀腺癌患者的一種或多種針對性的 合理的治療方式。2. 根據權利要求1的方法，其中的步驟2)的測序包括TERT啟動子區域從翻譯起始位點 算起的-124和-146。3. 根據權利要求1的方法，其中的步驟2)測定包括以下方法步驟： 1) 從生物樣品中提取DNA; 2) 用一特異引物特異地與TERT基因雜交結合； 3) 用聚合酶鏈反應(PCR)放大一個TERT基因啟動子片段，該片段包含有從TERT啟PCR動 子的翻譯起始位點算起的-124和-146區域;然后， 4) 測序PCR的擴增產物，以確定C228T和/或C250T突變的存在。4. 根據權利要求1的方法，對評估有高侵襲性甲狀腺癌做恰當的相應治療，可包括甲狀 腺全切，甲狀腺側切，放射性碘治療，和它們的組合。5. 根據權利要求1的方法，其中所述治療方法也包括給予所選者TERT抑制劑治療。6. -種鑒定受試者具有或可能發展成具有高侵襲性甲狀腺癌的方法，包括以下步驟： 1) 從所述受試者獲得生物樣品； 2) 在從受試者得到的樣品上做檢測，確定找到1,295,228C>T(C228T)和1,295,250C> T(C250T)突變，二者分別對應端粒酶逆轉錄酶啟動子上從翻譯起始位點算起的-124C>T 和-146C>T區域； 3) 如果C228T和/或C250T突變得以識別存在，則可鑒定受試者患有高侵襲性的甲狀腺 癌或有可能發展成高侵襲性的甲狀腺癌。7. 根據權利要求6所述的方法，其中的步驟2)包括測序一個TERT啟動子片段，包含從 TERT啟動子翻譯起始位點算起的-124和-146區域。8. 根據權利要求6的方法，其中的步驟2)測序包括以下方法步驟： 1) 從生物樣品中提取DNA; 2) 用一特異引物特異地與TERT基因雜交結合； 3) 用聚合酶鏈反應(PCR)放大一個TERT基因啟動子片段，該片段包含有從TERT啟動子 的翻譯起始位點算起的-124和-146區域;然后， 4) 測序PCR的擴增產物，以確定C228T和/或C250T突變的存在。9. 根據權利要求6所述的方法，還進一步包括對患有高侵襲性甲狀腺癌或患有可能發 展成高侵襲性甲狀腺癌的患者施用適合的治療。10. 根據權利要求9的方法，其中所述治療高侵襲性甲狀腺癌的方法包括甲狀腺全切， 甲狀腺側切，放射性碘治療，和它們的組合。11.根據權利要求9的方法，其中所述治療方法包括給予所述患者TERT抑制劑。
【專利摘要】本發明涉及癌癥領域。具體地，本發明提供了與某些癌腫瘤中基因啟動子突變有關的方法和組合系統。在一個代表性的實施方案中，用于治療患有甲狀腺癌的病人個體的方法包括下列步驟(a)獲得來自所述病人的生物樣品；(b)用該獲得的生物樣品做化驗檢測，以確定1,295,228C>T(C228T)和1,295,250C>T(C250T)突變，該兩個突變對應于從端粒酶逆轉錄酶(TERT)基因啟動子的翻譯起始位點的-124C>T和-146C>T；(c)如果檢測到了C228T和/或C250T突變，則可確定該病人有或可能發展成高危險的進展性的甲狀腺癌；(d)檢測出這樣有或可能發展成高危險的進展性的甲狀腺癌的患者后，可做更準確的風險預后評估，然后可對患者選用一種或多種恰當的治療方式，進行針對性的更有效的合理治療。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105431549
【申請號】CN201480018134
【發明人】麥克·明照·邢
【申請人】麥克·明照·邢
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2014年3月27日
【公告號】US20160040250, WO2014160834A1