?基因組DNA純 化系統，WaterMaster?DNA純化試劑盒）。試劑如DNAzoIt?和TR我Eeagcnt?>也可用于提取和/ 或純化的DNAANA可使用蛋白酶K和/或RNA酶進一步純化。
[0058]在進一步的實施方案中，引物/探針可用于擴增TERT基因，其包含啟動子的區域。 更具體地，引物/探針能夠擴增啟動子含有1,295,228 OT和1,295,250 OT(稱為C228T和 C250T分別）的區域，對應于-124 OT和-146 OT[從在端粒酶逆轉錄酶(TERT)基因的啟動 子翻譯位點起]。在一個實施方案中，引物包含SEQ ID N0中所示的核酸序列：2。在另一個實 施方案中，引物包含SEQ ID N0中所示的核酸序列：3。一種引物組可包含于SEQ ID N0所示 的核酸序列：2和SEQ ID N0:3。檢測方法不限于此，也可用其它檢測手段檢測兩個TERT啟動 子突變。
[0059]在具體實施方案中，引物接觸從被試者分離的DNA，在專門設立的條件下引物與 TERT基因雜交，形成引物和DNA的復合物。在典型的情況下，序列特異的引物延長可以用任 何可行的方法取得，其前提是引物所特異結合的核酸摸板序列指導決定著引物延長所形成 的產物序列和成分。以序列特異的引物延長因而包括，但不限于，PCR和DNA側序。如本文所 述，在某些實施方案中，引物可用于支持DNA擴增反應。典型地，引物將是能夠被擴展以序列 特異性的方式。延伸以序列特異性方式的引物包括，其中所述核酸分子的序列或組合物，其 中所述引物雜交的任何方法或以其他方式相關聯的指示或影響由引物的延伸產生的產物 的組合物或序列。因此擴展以序列特異性方式的引物包括，但不限于，聚合酶鏈反應，DNA測 序，DNA延伸，脫氧核糖核酸聚合，RNA的轉錄，或反轉錄。放大在一個特定的序列方式的引物 的技術和條件是優選的。在某些實施方案中引物被用于DNA擴增反應，如PCR或直接測序。也 應明白的是，引物延長也可通過非酶催化的方技術取得。在這個過程中，用于延長引物的核 苷酸或短鏈核苷，經特定的化學修飾，通過反應以序列特異的方式延長引物。典型的是，用 于延長引物的核苷酸或寡核苷酸修飾，使得它們將發生化學反應，以延伸引物中的序列特 異性的方式延長。典型地，所公開的引物雜交與本文公開的多核苷酸序列的本文所公開的 多核苷酸序列或區域，或者它們與本文或本文公開的多核苷酸序列的區域的補體所公開的 多核苷酸序列的補體雜交。
[0060] 引物或探針的相互作用與在某些實施例中本文所公開的多核苷酸序列的大小可 以是支持所需酶操作的引物，如DNA擴增或探針或引物的簡單雜交任何尺寸。典型的引物或 探針將是至少為6,7,8,9，10,20,30,40,50,60,70,80,90，100，125，150，175,200,225,250， 275,300,325,350,375,400,425,450,475,500,550,600,650,700,750,800,850,900,950， 1000，1250，1500，1750，2000，2250，2500，2750，3000，3500，或 4000 個核苷酸長或在兩者之 間的任何長度。
[0061] 探針或本發明引物可以通過常規技術公知的那些本領域的技術來制備。例如，該 探針可以使用固相合成使用市售設備來制備。修飾的寡核苷酸也可以通過類似的方法容易 地制備。所述探針也可根據本領域的標準方法直接合成在固體載體上。當所述多核苷酸探 針是一種核酸陣列的一部分合成的多核苷酸的這種方法是特別有用的。
[0062] 因此，本發明還提供了預測，診斷，和預后試劑盒，包括簡并引物來擴增靶核酸在 TERT基因和指令包括擴增和分析的結果。該試劑盒可以可選地還包含緩沖液，酶，以及用于 執行的擴增產物的擴增和分析的容器。所述試劑盒還可以是篩選，診斷或預后試劑盒，包括 其它工具，例如DNA微陣列的一個組成部分。在一些實施方案中，試劑盒還提供了一個或多 個控制模板，諸如核酸從正常組織樣品，和/或一系列表示上述TERT基因不同的方差的樣品 中分離。
[0063] 在一個實施方案中，試劑盒提供了至少一種引物能夠擴增TERT基因的不同區域 的。所述試劑盒可以包括在一個反應或幾個平行的反應中的生物樣品的附加引物的幾個基 因表達差異的分析。在試劑盒的引物可被標記，例如熒光標記，以便于檢測的擴增產物和核 酸vanan c e s的結果分析。
[0064] 在一個實施方案中，多于一個突變/方差可以在一個分析來檢測。因此，一個試劑 盒的組合將包括能夠放大TERT基因的不同片段的引物。試劑盒還可以包括能夠擴增另一基 因，其中包括BRAF基因片段的引物。可將引物差異化標記，例如，使用不同的熒光標記，從而 方差之間進行區分。所包含的試劑盒中的引物可以包括從互補序列TERT的編碼序列中選擇 引物。
[0065] 在某些實施方案中，患者可以被診斷或確定通過添加生物樣品（如血液或血清)從 患者的試劑盒獲得并檢測TERT啟動子突變（多個），例如通過一個方法，包括以下步驟：（i) 收集血液或血清從患者；（i i)將來自病人的血液的DNA;(i i i)加入從病人的診斷試劑盒的 DNA;和，（iv)檢測（或不）的TERT啟動子突變。在該示例性方法中，引物被帶入與患者的DNA 的接觸。引物:DNA復合物可以形成，例如，被PCR擴增，并且在一些實施方案中，測序，以檢測 TERT啟動子突變。在其它試劑盒和診斷實施方案中，血液或血清不需要從患者收集的（即， 它已經被收集）。此外，在其實施方案中，所述樣品可包括組織樣品，尿液或臨床樣品。
[0066] III .TERT調節劑（因子）
[0067] 在某些實施方案中，TERT調節劑（因子)包括小分子，多肽，核酸分子，肽模擬物，或 它們的組合的組中選擇。在一個具體實施方案中，所述試劑可以是多肽，多肽可以包含抗 體。在另一個實施方案中，所述試劑可以是核酸分子。所述核酸分子可以，例如，是一個TERT 抑制性核酸分子。T E R T抑制性核酸分子可包含一個短干擾R N A ( s i R N A)分子，微小R N A (miRNA)的分子，或反鏈分子。
[0068] A.真對TERT的抗體
[0069] 抗體這個術語在本文中用在廣義上，包括多克隆和單克隆抗體。該術語也可以指 一個人抗體和/或人源化抗體。人單克隆抗體的產生的例子包括那些由Cole等人描述的 [Cole et al.Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)) 和Boemer et al · (J. Immunol · 147( 1): 86-95(1991) ] ·人抗體（和其片段）也可以使用噬菌 體展不文庫中產生[(Hoogenboom et al.,J.Mol.Biol.227:381(1991);Marks et al·, J. Mo 1. Bio 1.222:581 (1991)]。所公開的人抗體也可以從轉基因動物獲得。例如，轉基因突 變小鼠，其能夠產生人抗體完整全集，響應于免疫，已經被描述了 [見Jakobovits et al.， Proc. Natl. Acad.Sci. USA 90:2551-5(1993)；Jakobovits et al.,Nature 362:255-8 (1993)；Bruggermann et al.,Year in Immunol·7:33(1993)]〇
[0070] 本領域中已知的各種方法可用于生產TERT抗體或任何亞基，或其片段，衍生物，同 系物或類似物的蛋白質的。
[0071 ]本發明的抗體包括但不限于，合成的抗體，多克隆抗體，單克隆抗體，重組制備的 抗體，細胞內抗體，多特異性抗體(包括雙特異性抗體），人抗體，人源化抗體，嵌合抗體，合 成抗體，單鏈Fvs(抗體）（包括雙特異性的scFv)，單鏈抗體Fab片段，F(AB '）片段，二硫鍵連 接的Fvs (sdFv)和抗獨特型(抗-Id)抗體，以及表位結合上述任何的片段。特別是，本發明的 抗體包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如，含有抗原結合位點免 疫特異性結合抗原的分子(比如，抗體的一個或多個互補決定區(CDR))。
[0072]對于根據本發明的抗體的制備的另一個實施方案是使用肽模擬物的。模擬物是模 擬蛋白質二級結構元件的含肽分子。參見，例如，Johnson et al.，"Peptide Turn Mimetics^in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY Pezzuto et al.,Eds.,Chapman and Hall, New York(1993).在設計合理的使用肽模擬物的背后的基本原理是，蛋白質的肽主鏈的存 在主要是定向氨基酸側鏈以這樣一種方式，以促進分子相互作用，諸如抗體與抗原的。 [0073]肽模擬物預期容許類似于天然分子的分子相互作用。這些原理可用于改造具有許 多的本文所公開的靶向抗體的自然屬性的第二代分子，但具有改變的甚至改進的特性。更 具體地，根據本合理的設計方法，肽圖譜可被用于確定"有效的"抗原識別的殘基，并且隨著 分子建模和分子動力學軌跡分析，含有抗原接觸殘基從多個CDR的抗體的肽模擬物可制備。 [0074]在一些實施方案中，抗體特異性結合的TERT蛋白的表位。但應該理解的是，肽區域 不一定精確地映射一個表位，但也可以含有TERT序列不是免疫原性的。預測其它潛在表位， 其中本發明的免疫球蛋白可結合的方法是本領域中公知的那些技術人員，包括，但不限于， Kyte-Doolittle Analysis(Kyte,J.and Do little,R.F.,J.MOL.BIOL.157:105-32 (1982)) ；Hopp and Woods Analysis(Hopp,T.P.and Woods,K.R·， 78PR0C. NATL. ACAD. SCI. USA 3824-28(1981))；Hopp,T.J. and Woods,R.,M0L. IMMUNOL.20： 483-89(1983)；Hopp,T.J.,J. IMMUNOL. METHODS 88：1-18(1986)；Jameson-ffolf Analysis (Jameson,B.A.and Wolf,H.,C0MPUT.APPL.BI0SCI.4：181-86(1988))；and Emini Analysis(Emini et al.,VIROLOGY 140:13-20(1985)).
[0075]本發明的抗體的氨基酸序列變體可以通過將適宜的核苷酸變化引入編碼抗體或 通過肽合成多核苷酸來制備。這樣的修飾包括，例如，抗體的氨基酸序列內從缺失和/或插 入和/或替代殘基。缺失，插入和替代的任何組合，可向在獲得最終的構建。
[0076] 氨基酸序列插入包括氨基端和/或羧基末端的融合，長度范圍從一個殘基至包含 上百或更多殘基的一個或多個氨基酸殘基，以及序列內插入的多肽。末端插入的例子包括 具有N端甲硫氨酰殘基或稠合于細胞毒性多肽的抗體的抗體。抗體分子的其它插入變體包 括融合到N末端或多肽，增加抗體的血清半衰期的抗體的C末端。
[0077] 另一種類型的抗體變體是氨基酸替代變體。這些變體在抗體分子中不同的殘基替 代至少一個氨基酸殘基。例如，對于抗體的替換性誘變最感興趣的位點包括高變區，但框架 區(FR)的改變也可以考慮。為是優選的用于取代，即，誘變位置的TERT抗體的某些殘基或區 域的識別一個有用的方法，是丙氨酸掃描誘變。見坎寧安與井，244版1081年至1085年（1989 年）。簡要地說，一個靶殘基或一組被鑒定(例如，帶電的殘基如精氨酸，天冬氨酸，組氨酸， 賴氨酸和谷氨酸)并用中性或帶負電荷的氨基酸替換(最優選丙氨酸或聚丙氨酸）來影響 相互作用的氨基酸與抗原。
[0078] 氨基酸位置顯示功能敏感性的取代是通過在進一步或其他的變體引入精煉或對 替代位點。因此，盡管用于引入氨基酸序列變異是預定的，但是突變本身的性質不需要預先 決定。例如，為了分析突變的性能在給定的位點，丙氨酸掃描或隨機誘變可在靶密碼子或區 域，并篩選所需活性所表達的抗體變體進行。
[0079] 在抗體的生物學特性的實質性修飾可通過選擇在它們的效果顯著不同上的取代， 維持多肽主鏈的結構，在取代區域，例如，作為片層或螺旋構象，來實現（? )的電荷或該分 子的疏水性在靶位點，或（iii)的側鏈體積的。天然存在的殘基分成基于共同的側鏈性質的 基團：
[0080] (1)疏水性的：正亮氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸；
[0081 ] (2)中性親水的：cys，絲氨酸，蘇氨酸；
[0082] (3)酸性:天冬氨酸，谷氨酸；
[0083] (4)基礎:ASN，GLN，組氨酸，賴氨酸，精氨酸；
[0084] (5)殘基影響鏈方向的:甘氨酸，親;和
[0085] (6)芳族的：trp，TYR，PHE。
[0086] 非保守替代將需要交換其中之一的一個成員。保守置換包括在同一個類中交換的 氨基酸。
[0087] 任何不參與維持抗體也正確構象的半胱氨酸殘基可以被取代，通常用絲氨酸，以 改進分子的氧化穩定性和防止異常交聯。相反，半胱氨酸鍵(多個)可以加入到該抗體，以提 高其穩定性，特別是當抗體是免疫球蛋白片段，如Fv片段。
[0088] 另一種類型的替代變體涉及替代親本抗體的一個或多個高變區殘基。通常，所得 到的變體(多個），即，如上述所定義的功能等價物，選擇用于進一步開發將具有改進的相對 于從產生它們的親本抗體的生物學特性。一種便利方法用于產生此類替代變體是通過使用 噬菌體展示的親和力成熟。簡言之，將數個高變區位點（例如，6-7個位點）突變，產生所有可 能的氨基酸取代在每個站點。變體如此產生的抗體顯示在單價形式絲狀噬菌體顆粒融合到 基因 III產物的Ml 3的各個顆粒內包裝。噬菌體展示的變體，然后篩選其生物學活性(例如， 結合親和力)如本文中所公開的。
[0089] 為了鑒定候選高變區位點修飾，丙氨酸掃描誘變可以執行，以確定高變區殘基顯 著有助于抗原結合。可替代地，或另外，它可能是有益的分析抗體-抗原復合物的晶體結構 以鑒定抗體和抗原之間的接觸點。所述接觸殘基及鄰近殘基是依照本文詳述的技術進行替 代的候選。一旦產生，變體組進行篩選如本文所述的抗體和具有優異性能的一種或多種相 關測定法中，可以選擇用于進一步開發。可以期望來修改本發明的抗體，即，創建功能等價 物，相對于效應子功能，例如，以便增強抗原依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)和/或補體 依賴性細胞毒性(CDC)的抗體。這可通過在抗體的鐵區中引入一個或多個氨基酸替代來實 現。或者或另外，半胱氨酸殘基可能在鐵區中引入，由此允許形成鏈間二硫鍵在這一地區。 如此生成的同二聚體抗體可具有改善的內化能力和/或增加的補體介導的細胞殺傷和抗體 依賴性細胞毒性(ADCC)[見Caron et al.J.EXP MED.176:1191-95(1992);Shopes，J.
[0090] IMMUNOL. 148:2918-22( 1992)].還有Wolff等人描述的，用異雙功能交聯劑可制具 有增強抗腫瘤活性的同二聚體抗體[見Wolff et al. CANCER RESEARCH 53:2560-65 (1993)]。或者，抗體可改造成具有雙重的Fe區，由此可具有增強的補體溶解和ADCC能力 [見Stevenson et al.ANTI-CANCER DRUG DESIGN 3:219-30(1989)]。
[0091] 為了增加抗體的血清半衰期，人們可以將補救受體結合表位引入抗體(尤其是免 疫球蛋白片段），如在美國專利號5,739,277中所描述的。如本文所用，術語"補救受體結合 表位"指IgG分子的Fe區的表位(例如，IgG 1，的IgG2，IgG3或IgG4)，其負責增加體內血清半 衰期IgG分子。
[0092] 編碼抗體氨基酸序