列變體的多核苷酸分子被多種本領域已知的方法制備。這些方 法包括，但不限于，隔離從天然來源(在天然存在的氨基酸序列變體的情況），或制備通過寡 核苷酸介導的（或位點定向）誘變的較早制備，PCR誘變，和盒式誘變變體或非變體版本發明 的抗-TERT抗體。
[0093] B.TERT的小分子調節劑
[0094]在其他實施方案中，TERT調節是一種小分子。在一個具體的實施方案中，TERT調節 劑是拮抗劑BIBR1532 (2-[ (E) -3-環烴-2-基丁-2-烯酰基氨基]苯甲酸）[見Ward&Autexier， Mol .Pharmacol .68:779-786,2005;和 J. Biol. Chem. 277( 18) :15566-72,2002) .TERT 調制器 拮抗劑還可以包括TMPyP4(四-(N-甲基-4-吡啶基）卟啉），端粒酶抑制劑LX(MST312)， MnTMPyp五氯化BPPA，[3玉紅霉素，曲古抑菌素 A，木香，阿霉素，蘇拉明鈉，和(-)-沒食子酸 Epigallocatchin(和其他兒茶酚類）。術語"小分子有機化合物"是指有機化合物通常具有 分子量大于約5000，4000，3000，2000，1000，800，600，500，250或100道爾頓以下，優選小于 約500道爾頓。一種小分子有機化合物可制備的有機合成技術，例如通過組合化學技術，或 者它可以是一個天然存在的小分子有機化合物。
[0095]化合物庫可篩選TERT調節劑。這樣的化合物庫是一個混合物或集合生成的，或以 任何方式獲得的一種或多種推定的調節劑。任何類型的分子，其能夠相互作用，結合或具有 用于TERT親和力可存在于所述化合物庫。例如，化合物文庫篩選用本發明可能包含天然存 在的分子，例如碳水化合物，單糖，寡糖，多糖，氨基酸，肽，寡肽，多肽，蛋白質，受體，核酸， 核苷，核苷酸，寡核苷酸，多核苷酸，包括DNA和DNA片段，RNA和RNA片段和類似物，脂質，類視 色素，類固醇，糖肽，糖蛋白，蛋白多糖等;或類似物或天然存在的分子，例如肽模擬物等的 衍生物;和非天然存在的分子，如"小分子"的有機化合物產生的，例如，使用組合化學技術； 和它們的混合物。
[0096]分子化合物庫通常包含多于一個假定的調節劑或部件，即，多個構件或者推定的 調節劑。在某些實施方案中，化合物庫可以包括小于約50，000，25000，20000，15000，10000， 5000，1000，500或100推定的調節劑，特別是約5至約100，5至約200，5至約300，5至約400，5 至約500，10至約100，10至約200，10至約300，10至約400，10至約500，10至約1000，20至約 100，20 至約 200，20 至約 300，20 至約 400，20 至約 500，20 至約 1000，50 至約 100，50 至約 200，50 至約 300，50 至約 400，50 至約 500，50 至約 1000，100 至約 200，100 到約 300，100 至約 400，100 至 約 500，100 至約 1000，200 至約 300，200 至約 400，200 至約 500，200 到約 1000，300 至約 500，300 至約 1000,為 300 ~2000,為 300 ~3000,為 300 ~5000,為 300 ~6000,300 ~10，000,500 至約 1000，500 到約 2000，500 至約 3000，500 至約 5000，500 至約 6000，或 500 至約 10，000 推定的調 節劑。Inparticular實施方案中，化合物文庫可以包括小于約50，000,25000，20000，15000， 100005000,1000,或500推定的調節劑。
[0097] 化合物文庫可制備或通過任何手段，包括獲得，但不限于，組合化學技術，發酵方 法，植物和細胞提取程序等。庫可以由合成或從天然來源，例如，微生物，植物，海洋，病毒 和動物原料而得到。用于制備庫是公知的現有技術。參見，例如，E. R.Felder，Chimia 1994， 48:512-541；Gallop et al.,J.Med.Chem.1994,37：1233-1251；R.A.Houghten,Trends Genet.1993,9：235-239；Houghten et al.,Nature 1991,354：84-86；Lam et al.,Nature 1991,354：82-84；Care 11 et al.,Chem. Bio 1.1995,3：171-183；Madden et al., Perspectives in Drug Discovery and Design 2 ： 269-282；Cwirla et al ., Biochemistry 1990,87：6378-6382；Brenner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1992,89： 5381-5383；Gordon et al.,J.Med.Chem.1994,37：1385-1401；Lebl et al.,Biopolymers 1995，37:177-198;及其它引用的參考文獻。
[0098] 化合物庫也可以從商業來源，例如，從Maybridge公司，ChemNavigator · com， Timtec公司，ChemBridge公司公司是一家Syntese生物技術的接入點，阿科什_SC，G&J研究 化學品有限公司，生命化學，Interchim SA和光譜信息有限公司。
[0099] C.以TERTmRNA為靶向的RNA干擾成分
[0100] 在本發明的一個方面，TERT的表達可通過使用RNA干擾技術(RNAi)得以抑制。RNAi 是一種非常有效的方法，由此雙鏈RNA(dsRNA)的誘導同源mRNA在動物和植物細胞中的序列 特異性降解。見Hutvagner and Zamore，CURR· 0ΡΙΝ· GENET · DEV· 12:225-32(2002);Hammond et al.，NATURE REV.GEN.2:110-19(2001) ;Sharp，GENES DEV. 15:485-90(2001) .RNAi可以 被觸發，例如，通過核苷酸(NT)雙工的小干擾RNA(siRNA)(見Chiu et al.，M0L.CELL.10:549-61(2002)；Elbashir et al.,Nature 411：494-98(2001))〇micr〇-RNAs(miRNA), functional small-hairpin RNA(shRNA),or other dsRNAs which are expressed in- vivo using DNA templates with RNA polymerase Illpromoters·微RNA(microRNA)、功 能小發夾RNA(shRNArna)或其他的dsRNA是在活體內的表達是使用DNA為模板用RNA聚合酶 III啟動子驅動。見 Zeng et al.,M0L.CELL.9:1327-33(2002) ;Paddison et al·, GENES DEV.16:948-58(2002)；Lee et al.,NATURE BI0TECHN0L.20：500-05(2002)；Paul et al., NATURE BI0TECHN0L.20：505-08(2002)；Tuschl,NATURE BI0TECHN0L.20：440-48(2002)；Yu et al.,PR0C.NATL.ACAD.SCI.USA,99(9):6047-52(2002)；McManus et al.,RNA 8:842-50 (2002)；Sui et al.,PR0C.NATL.ACAD.SCI.USA 99(6):5515-20(2002).
[0101] 無需進一步詳細說明，據信本領域技術人員中，使用前面的描述中，可以利用本發 明的最大程度。
[0102] 以下實施例僅是說明性的，而不是以任何方式限制本公開內容的其余部分。
[0103] 示例
[0104] 把以下實施例闡述，以便提供對于本領域的技術人員在對如何化合物，組合物，物 品，裝置和/或所描述和要求保護的本文方法制成做評價，并且意在一個完整的公開和描述 是純粹是示例性的，并非旨在限制發明人視為其發明的范圍。已作出努力以確保準確性相 對于數字(例如，量，溫度等），但一些誤差和偏差應占本文中。除非另外指出，否則，份是重 量份，溫度是度.攝氏或處于環境溫度，壓力為大氣壓或接近大氣壓。有無數的變型和組合 的反映條件，如組分濃度，所需溶劑，溶劑混合物，溫度，壓力和可用于優化由所述方法獲得 的產物純度和產率的其他反應范圍和條件。只有合理和常規的實驗將需要優化這樣的工藝 條件。
[0105] 高危險高進展性甲狀腺癌中高發的TERT啟動子突變端粒酶，為核糖核蛋白復合 體，其功能為維持染色體末端端粒長度，在細胞永生和腫瘤發生中起關鍵作用（Smekalova 等人2012，M〇Cellin等人2013)。其催化亞基端粒酶逆轉錄酶(TERT)基因的啟動子突變在第 5染色體TERT基因最近Smekalova et aUOW^ocellin et al.2013)已報道在黑素瘤 (Horn et al.2013，Huang et al.2013)。兩個TERT啟動子突變，1295228 C>T和 1295250 C> T(被稱為C228T和C250T在這里分別），是特別常見的。它們分別代表了TERT啟動子-124 C> T和-146 C>T的核苷酸改變(-1表示ATG翻譯起始位點的A的上游）。兩個突變創建一個11堿 基的核苷酸拉伸片斷5'-CCCCTTCCGGG-3'（SEQIDN0:l)，其中包含一個共識結合位點， GGAA(在反向互補），是ETS轉錄因子的結合點，這表明這些突變有潛在的重要生物相關功 能。事實上，這兩個突變已證明賦予TERT啟動子增加的轉錄活性(Horn et al .2013，Huang et al. 2013)。這些突變不存在于正常人類受試者和公共基因數據庫，所以它們是癌癥特異 性體細胞的遺傳改變，支持其在人類腫瘤潛在的重要作用。這是符合在一些人類癌癥中先 前觀察到的增加端粒酶活性的研究結果的（Smekalova et al. 2012，Mocellin et. 2013)。 因此，TERT啟動子突變，通過促進端粒酶催化亞單位的表達響應于ETS轉錄因子結合，可能 代表一由端粒酶在人類腫瘤發生中起重要作用的新機制。黑素瘤和濾泡細胞衍生的甲狀腺 癌有相當類似的遺傳背景；例如，他們都有高發的BRAF V600E突變戴維斯等人(Davies et al.2002;Xing 2005a)。這促使我們在本研究中研究探索甲狀腺癌TERT啟動子的突變。
[0106] 濾泡細胞來源的甲狀腺癌是一種常見的內分泌惡性腫瘤。類似的黑色素瘤，其發 病率近年來已迅速上升（Jemal et al.2011，Howlader et al.2012)。濾泡細胞衍生甲狀腺 癌可分為幾種組織學類型（DeLelliset al，2004)，其中最常見的類型是乳頭狀甲狀腺癌 (卩1'〇和濾泡甲狀腺癌（卩1'〇，分別占所有甲狀腺癌的85-90%和10-15%(061^11&的 al · 2004, Jemal et al · 2011，Howlader et al · 2012) WTC可以進一步分為幾個亞型或變 型。最常見的包括常規的PTC(CPTC)，濾泡型PTC(FVPTC)，和高柱細胞的PTCXTCPTChPTC的 其他亞型是罕見的。未分化甲狀腺癌(ATC)少見，但很兇險（Smallridge et alJOWhPTC 和FTC是分化癌(DTC)，總的來講是慢進展型甲狀腺癌。也有低分化甲狀腺癌(PDTC)，其具有 介于DTC和ATC之間的侵襲略性。濾泡旁C-細胞衍生的甲狀腺髓樣癌MTC)是不常見的。良性 甲狀腺瘤遠比甲狀腺癌較常見。不同的遺傳改變確定了甲狀腺癌的發展。異常驅動的各種 信號通路，在甲狀腺腫瘤發生中起基礎性作用(Xing，2013年）。在本研究中，我們研究TERT 啟動子突變在不同的甲狀腺腫瘤的意義，探索新的遺傳改變在甲狀腺腫瘤發生中的作用。
[0107] 材料和方法
[0108] 甲狀腺腫瘤組織，細胞系，和DNA。基因組DNA從甲狀腺腫瘤組織和細胞系用蛋白酶 K消化，酚-氯仿提取，乙醇沉淀的標準方法分離。使用人體甲狀腺組織是根據機構倫理審查 委員會批準的協議，并獲得合適的書面患者的知情同意。這項研究包括85良性甲狀腺瘤， 257 PTC(包括 187 CPTC，56 FVPTC，13 TCPTC和1 柱狀PTC)，79常規FTC，8 PDTC，54 ATC和16 MTC樣品。甲狀腺癌細胞系包括TPCI，C643，Hth7，FTC133，0CUT-1，K 1，局，BCPAP，SW1736， KAT IS，Hth74和WR0。其甲狀腺腫瘤起源列于表1。
[0109] 表1.個別甲狀腺癌細胞系的TERT啟動子突變狀態
[0111] 腳注:PTC，甲狀腺乳頭狀癌;FTC，甲狀腺濾泡狀癌;ATC，甲狀腺未分化癌；"Heer"， 雜；"Homo"，合子。
[0112] TERT啟動子突變鑒定。標準的PCR反應進行基因測序，以確定TERT啟動子突變。簡 言之，TERT啟動子的一個片段用PCR擴增，DNA引物為5'AGTGGATTCGCGGGCACAGA-3'（2SEQ ID NO)(正向）和CAGCGCTGCCTGAAACTC-3 '（ SEQ ID NO: 3)(反向）。這樣產生 了一個235堿基對的 PCR產物，起含有黑色素瘤中出現的突變C228T和C250T位點（Hornet al，2013;Huanget al， 2013)。大約40-50ng基因組DNA進行的PCR，其進行與起始變性步驟在95°C下3分鐘時，隨后 的95°C變性30秒，55°C退火30秒10個循環，和68°C延伸1分鐘。然后將其隨后的除伸長相同 的設置30個循環，額外在每個周期加5秒。PCR在68°C下7分鐘的最終延伸步驟完成。PCR產物 的質量確認通過凝膠電泳，測序進行PCR用Big Dye終止v3的0.1循環測序現成反應試劑盒 (App 1 ied Biosystems公司）和ABI PRISM 3730 自動下一代遺傳分析儀（App 1 ied Biosystems公司）在約翰霍普金斯大學的測序中心完成。當發現一個突變時，通過使用反義 引物重復測序，以確認突變的重復檢測的重復性。
[0113] BRAF V600E突變的檢測。BRAF V600E突變分析如先前所描述的（Hu et al，2006)。 簡言之，將包含T1799A(V600E)突變的BRAF基因的15號外顯子進行PCR擴增，所用引物為 TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA(SEQ ID N0:4)(正向）和GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA(SEQ ID N0: 5)(反向），產生一個212bp的產物。PCR設置包括95°C5分鐘1個周期，95°C1分鐘，60°C1分鐘， 和72°C1分鐘，2個周期;95°C1分鐘，58°C1分鐘，和72°C1分鐘，2個周期;95°C1分鐘，56°C1分 鐘，和72°C1分鐘，35個周期。最后在72°C的延伸5分鐘。質量確認通過瓊脂糖凝膠電泳實現。 如上述，PCR產物進行大染料反應和測序分析TERT突變。所有的突變同時使用正向和反向引 物證實。
[0114] 結果
[0115] 實施例一：甲狀腺癌的細胞系和甲狀腺腫瘤的TERT啟動子突變。如圖1所示，兩個 TERT啟動子突變在甲狀腺癌細胞系和不同的甲狀腺癌腫瘤樣品的正鏈（圖1A)和反鏈（圖 IB)檢測代表電泳圖。在表1對測試的12個甲狀腺癌的細胞系的TERT啟動子突變狀態進行總 結。野生