專利名稱：一株釀酒酵母菌株及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株釀酒酵母菌株及其應用。
背景技術：
酵母菌是一類單細胞真菌的總稱，并非系統演化分類的單元。酵母菌是人類文明 史中被應用得最早的微生物。目前已知有1000多種酵母菌，根據酵母菌產生孢子(子囊孢 子和擔孢子)的能力，可將酵母分成三類形成孢子的株系屬于子囊菌或擔子菌，不形成孢 子但主要通過芽殖來繁殖的稱為不完全真菌，或者叫“假酵母”(Kreger-van R，Groningen N Y. The yeasts -.a taxonomic study. Third revisedand enlarged edition[M]. The Netherlands =Elsevier science publishers B. V，1984.)。目前已知大部分酵母被分類到 子囊菌門。酵母菌在自然界分布廣泛，主要生長在偏酸性的潮濕的含糖環境中，例如，在水 果、蔬菜、蜜餞的內部和表面以及在果園土壤中最為常見(于景芝.酵母生產與應用手冊 [M],中國輕工業出版社，2005)。酵母營專性或兼性好氧生活，目前未知專性厭氧的酵母。 在缺乏氧氣時酵母進行無氧呼吸，其中發酵型的酵母可以通過糖酵解途徑(EMP途徑)將糖 類轉化成為丙酮酸，丙酮酸再被進一步轉化成為二氧化碳和乙醇來獲取能量(王鏡巖，朱 勝庚，徐長法.生物化學(第三版，下冊).北京高等教育出版社.2002:82)。在酒精工業 上，利用發酵型的酵母無氧呼吸可產乙醇的特點，將酵母可以利用的發酵性糖轉化為酒精。乙醇作為可再生能源，可直接作為液體燃料或者同汽油混合使用，燃料乙醇作為 新的燃料替代品，可減少對不可再生能源-石油的依賴，保障國家能源的安全。現行酒精工 業生產采用較多的是發酵法采用各種含糖(雙糖)、淀粉(多糖)的農產品或農林業副產 物為原料，經過水解(即糖化)多糖轉化為單糖后發酵、或直接發酵雙糖轉化為乙醇。淀粉 質在淀粉酶類的作用下，水解為葡萄糖，再進一步發酵生成乙醇(馬贊華.酒精高效清潔生 產新工藝[M].化學工業出版社，2003)。廣西地處亞熱帶地區，非糧經濟作物甘蔗和木薯的種植面積和產量皆為全國第 一。甘蔗主要用于制糖，糖蜜是甘蔗制糖的副產物，含有大量酵母可發酵性糖。鮮木薯塊 根的淀粉含量達30%，木薯淀粉經過α -淀粉酶液化和糖化酶糖化后轉化為酵母可發酵性 糖-葡萄糖。糖蜜和木薯淀粉是酵母發酵產酒精的優良生產原料。2008年，廣西中糧生物 質能源有限公司已在廣西北海建成并投產以糖蜜和木薯為原料年產20萬噸燃料乙醇的生 產設備。另外，廣西還有2家公司較大規模地以糖蜜和木薯為原料生產乙醇，分別為位于欽 州市的新天德股份有限公司和位于平果縣的平果凱特生物化工股份有限公司。釀酒酵母是酒精工業發酵生產上常用的微生物菌種。酒精工業生產中對菌株的要 求越來越高，首先要求酵母菌具有極高的產酒效率，對發酵性糖的轉化率高，不造成糖質原 料的浪費；其次是發酵液成熟之后酒精含量高，降低蒸餾能耗；再次是發酵速度快，提高設 備的利用率，降低生產成本(江寧.生物液體燃料——燃料酒精[J]. Chinese Journal of Nature, 2007, 29(1) 30-33)。限制這三大要求的主要因素是酵母對高濃度發酵性糖和酒精的耐受力、對原料的轉化率和對各種不利發酵條件(如高溫、低PH和有毒物質等)的耐受 力。國內酒精工業生產中廣泛應用的釀酒酵母為湖北安琪酵母股份公司生產的耐高溫活性 干酵母(安琪酵母，簡稱為AQ)，雖然發酵特性較好，但也難以滿足工業上的更高要求。
發明內容
本發明的目的是提供一株釀酒酵母菌株及其應用。本發明提供的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，命名為ZM1-5，簡稱釀酒酵 母ZM1-5或ZM1-5，分離自廣西壯族自治區欽州市果園土壤，已于2010年4月23日保藏于 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰 西路1號院3號)，保藏號為CGMCC No. 3761。釀酒酵母ZM1-5可用于生產酒精。用于生產酒精時，釀酒酵母ZM1-5可以單獨使用，也可與其它釀酒酵母混合使用。應用所述釀酒酵母ZM1-5生產酒精時，pH值為3-9，溫度為28-42°C。應用所述釀 酒酵母ZM1-5生產酒精時，pH值優選為4-5。應用所述釀酒酵母ZM1-5生產酒精時，溫度優 選為28-40°C，溫度最優選為32°C。本發明還保護一種生產酒精的方法，是通過發酵釀酒酵母ZM1-5，得到酒精。所述方法中，用于發酵的底物具體可為葡萄糖和/或蔗糖。所述方法中，用于發酵的底物可為木薯產品(如木薯粉液化醪)、糖蜜和甘蔗汁中 的至少一種。所述發酵的溫度可為32°C至42°C中的任一溫度，如32°C、37°C、40°C或42°C。所述發酵起始時，所述釀酒酵母ZM1-5在發酵體系中的濃度可為1. 5X IO7至 2. 5 X IO7 個細胞 /mL，優選為 1. 5 X 107-2. 0 X IO7 個細胞 /mL 或 2. 0 X 107-2. 5 X IO7 個細胞 /mL,如 1. 5 X IO7 個細胞 /mL、2. 0 X IO7 個細胞 /mL 或 2. 5 X IO7 個細胞 /mL。釀酒酵母ZM1-5具有以下生理特征(1)在酵母粉蛋白胨瓊脂平板上32°C培養 2-3天，菌落為乳白色、隆起、表面光滑、邊緣整齊；細胞圓形或橢圓形，無性繁殖方式為芽 殖；(2)菌株最適生長和發酵溫度32°C;pH范圍3-9 ；最適生長pH4_5 ； (3)該菌株在32°C、 37°C和42°C的生長速率快于安琪酵母；(4)該菌株能在50%的葡萄糖培養基上生長；該菌 株能在含有抑制物1.6mol/L妝(1、16%乙醇、48/1乙酸、20(^8/1^418的￥ 0培養基上生 長；(5)應用于以木薯粉液化醪、糖蜜和甘蔗汁為原料發酵生產酒精時，酒精產量和發酵效 率比目前工業生產用安琪耐高溫活性干酵母高。與現有工業生產常用的安琪耐高溫酵母菌比較，酵母菌株ZM1-5具有生長快、酒 精產量高、耐高溫、耐高糖、耐高濃度乙醇和耐酸等多個優點。釀酒酵母ZM1-5可應用于以 木薯粉、糖蜜和甘蔗汁等為原料的濃醪發酵產酒精工藝(同步糖化發酵)中，解決工業生產 中酵母菌不能耐受高滲透壓、高濃度乙醇和發酵后期效率低等問題，降低酒精工業生產的 成本。與安琪耐高溫酵母菌相比，釀酒酵母ZM1-5在高溫條件下發酵具有更高的酒精產量。 酵母菌株ZM1-5用于同步糖化發酵產酒精工藝中，有望解決濃醪發酵中底物濃度高(滲透 壓高)、發酵罐內溫度高、發酵后期酵母菌受高濃度酒精抑制等問題。
圖1為ZM1-5和AQ在各種高溫條件下在YPD平板上的照片。圖2為30°C時ZM1-5和AQ在各種濃度NaCl的YPD平板上的照片。圖3為30°C時ZM1-5和AQ在各種濃度乙醇的YPD平板上的照片。圖4為30°C時ZM1-5和AQ在各種濃度乙酸的YPD平板上的照片。圖5為30°C時ZM1-5和AQ在各種濃度G418的YPD平板上的照片。圖6為30°C時ZM1-5和AQ在50%葡萄糖的YPD平板上的照片。圖7為ZM1-5和AQ在不同培養溫度下在YPD平板上的形態；A =AQ在32°C的菌落 形態；B :ΖΜ1-5在32°C的菌落形態；C :AQ在37°C的菌落形態；D :ZM1_5在37°C的菌落形態； E =AQ在42°C的菌落形態；F :ΖΜ1-5在42°C的菌落形態。圖8為ZM1-5和AQ在電子掃描顯微鏡下的形態；A =AQ在32 °C培養時細胞的顯 微形態；B :ΖΜ1-5在32°C培養時細胞的顯微形態；C =AQ在42°C培養時細胞的顯微形態；D ZM1-5在42°C培養時細胞的顯微形態。圖9為ZM1-5與AQ在不同pH條件下生長24h的菌體量比較。圖10為ZM1-5與AQ在不同溫度條件下生長20h的菌體量比較。圖11為ZM1-5與AQ在不同溫度條件下的生長曲線比較；A =AQ ；B :ZM1_5。圖12為ZM1-5與AQ在不同溫度下發酵葡萄糖72h后的酒份比較。圖13為ZM1-5與AQ在不同溫度下發酵蔗糖72h后的酒份比較。圖14為ZM1-5與AQ發酵木薯粉液化醪結果分析；A 酒份；B 活菌濃度；C 殘總 糖；D 殘還原糖。圖15為ZM1-5與AQ發酵甘蔗汁產物結果分析；A 酒份(滅菌甘蔗汁為底物)；B 酒份(新鮮甘蔗汁為底物)；C 殘糖含量(滅菌甘蔗汁為底物)；D 殘糖含量(新鮮甘蔗汁 為底物)；E =CO2失重(滅菌甘蔗汁為底物)；F =CO2失重(新鮮甘蔗汁為底物)。圖16為ZM1-5與AQ在不同溫度下發酵甘蔗糖蜜結果分析；A 酒份；B =CO2失重。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。安琪酵母(AQ，耐高溫活性干酵母)購自湖北安琪酵母股 份公司。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質量百分含量。YPD培養基(pH4. 5)酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，固體培養基 含瓊脂15g/L。YPD+50% Glu 培養基(ρΗ4· 5) 固體培養基含瓊脂15g/L。YPD+20% Glu 培養基(ρΗ4· 5) 固體培養基含瓊脂15g/L。YPD+20% Sue 培養基(ρΗ4· 5) 體培養基含瓊脂15g/L。實施例1、酵母菌株ZM1-5的獲得酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖500g/L， 酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖200g/L， 酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、蔗糖200g/L，固
一、酵母菌株ZM1-5的獲得1、樣本采集樣品果園土壤。采集地點廣西壯族自治區欽州市農村。2、酵母菌株的分離采用稀釋涂平板法進行分離稱取Ig 土壤于IOOmL三角瓶中，加入IOmL滅菌蒸餾 水，置于28°C、轉速為ISOrpm的恒溫搖床震蕩2小時，取ImL懸濁液稀釋至10入10_2、10_3、 10_4、10_5稀釋度，各稀釋梯度分別取100 μ L涂布YPD平板，置于32°C恒溫培養箱培養2天 后挑出單菌落。3、酵母菌株的篩選酵母菌的具體篩選步驟如下①觀察平板上長出的菌落形態，并鏡檢其細胞形態，對其中確定為酵母菌的菌落 進行純化，純化后作為備選菌株進行菌株耐高溫生長試驗；②純化后的菌株分別置于32°C、37°C、42°C培養3_5天，觀察菌體生長情況，選出 耐高溫酵母菌株。③各耐高溫酵母菌株分別點接于YPD培養基上，32°C培養48小時，長出菌落后倒 入TTC上層培養基(紅四氮唑TTC 0.058，葡萄糖0.58，瓊脂1.5g，水IOOmL)，避光保溫 2-3h，選出顯色較深的酵母菌株。 ④TTC篩選得到的酵母菌株分別接入YPD液體培養基中，28。C、ISOrpm搖床過夜培 養，菌液按OD6tltl = 0. 01的終濃度接入帶有杜氏小管的YPD液體培養基中，分別置于32°C、 37°C、40°C、42°C下培養，分別在12h、24h和48h觀察和記錄杜氏小管中產氣情況，選出產氣 較多的酵母菌株。⑤杜氏發酵檢測產氣快且多的菌株接入50mLYPD液體培養基，28°C、ISOrpm搖床 培養24h，按10%的接種量(體積百分含量)接入裝有IOOmL含YPD+20%Glu液體培養基 的250mL三角瓶，發酵72h后蒸餾檢測其酒精產量。⑥酵母菌在各種培養基上的抗逆性生長檢測采用休止細胞梯度生長實驗，將酵母菌接種于20mL的YPD液體培養基中， 32 0C培養12h (OD600 = 0 . 7)，離心收集菌體，制備休止細胞。調節菌液濃度為0D_ = 1.0，并稀釋至IOciUO-1UO-2UO-3UO-4的濃度，分別取4μ1點接于各種高滲透壓培養基 [YPD+NaCl (1. 2mol/L, 1. 4mol/L, 1. 6mol/L)，YPD+50 % Glu]平板，以及 YPD+ 乙醇(12%, 14%,16% ), YPD+ 乙酸(3g/L, 4g/L), YPD+G418 (100 μ g/L, 200 μ g/L)平板，經 32°C 培養 2-3天，觀察菌落生長情況。本段中的％均為體積百分含量。通過以上分離和篩選，得到33株酵母菌，其中一株各方面性狀良好，將其命名為 菌株ZM1-5。ZM1-5和AQ在各種高溫條件下在YPD平板上的照片見圖1。30°C時ZM1-5和AQ 在各種濃度NaCl條件下在YPD平板上的照片見圖2。30°C時ZM1-5和AQ在各種濃度乙醇 條件下在YPD平板上的照片見圖3。30°C時ZM1-5和AQ在各種濃度乙酸條件下在YPD平板 上的照片見圖4。30°C時ZM1-5和AQ在各種濃度G418條件下在YPD平板上的照片見圖5。 30°C時ZM1-5和AQ在50%葡萄糖條件下在YPD平板上的照片見圖6。二、釀酒酵母ZM1-5的鑒定
ZM1-5 分別在 YPD 平板上 32°C、37°C、42°C培養 2 天，32°C、37°C 生長旺盛，42°C也 能生長。菌落為乳白色、隆起、表面光滑、邊緣整齊(見圖7)。顯微鏡下細胞圓形或橢圓形， 無性繁殖方式為多邊芽殖(見圖8)。ZM1-5可同化果糖、棉子糖、半乳糖、麥芽糖、纖維二糖、蜜二糖、海藻糖、松三糖、 α-甲基D葡萄糖苷、N-乙酰葡萄糖胺；ΖΜ1-5可同化硫酸銨、硝酸鉀；ΖΜ1-5可發酵葡萄糖、 蔗糖、麥芽糖、半乳糖，不可發酵乳糖。根據ΖΜ1-5的形態與生理生化特征，參考《The Yeast))和《常見與常用真菌》，將 ZM1-5鑒定為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。將釀酒酵母ZM1-5保藏于中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 3761。實施例2、釀酒酵母ZM1-5與安琪酵母AQ的最適生長pH值的比較釀酒酵母ZM1-5與安琪酵母AQ采用完全相同的條件進行處理，確定最適生長pH 值。1、將酵母菌(釀酒酵母ZM1-5或安琪酵母AQ)過夜培養，檢測菌液的0D_值。2、按OD6tltl = 0.01終濃度將菌液接入不同pH值(3、4、5、6、7、8或9)的YPD液體培 養基中，28°C、ISOrpm培養24小時，用分光光度計于600nm波長下測定光密度值(0D_值)。設置三次重復試驗，結果取平均值。ZM1-5與AQ生長24h的菌體量比較見圖9。釀 酒酵母ZM1-5與安琪酵母AQ的最適生長pH均為4-5。實施例3、釀酒酵母ZM1-5與安琪酵母AQ的最適生長溫度的比較釀酒酵母ZM1-5與安琪酵母AQ采用完全相同的條件進行處理，確定最適生長溫度。1、將酵母菌(釀酒酵母ZM1-5或安琪酵母AQ)過夜培養，檢測菌液的0D_值。2、按OD6tltl = 0.01終濃度將菌液接入YPD液體培養基(pH4. 5)中，不同溫度(28°C、 32°C、35°C、37°C、40°C或 42°C )、180rpm 培養 20 小時，檢測菌液的 OD600 值。設置三次重復試驗，結果取平均值。ZM1-5與AQ在不同溫度條件下生長20h的菌體 量比較見圖10。釀酒酵母ZM1-5與安琪酵母AQ的最適生長溫度均為32°C，釀酒酵母ZM1-5 在28-42°C溫度下生長量均比安琪酵母AQ高。實施例4、釀酒酵母ZM1-5與安琪酵母AQ在不同溫度下生長曲線的比較釀酒酵母ZM1-5與安琪酵母AQ采用完全相同的條件進行處理，比較不同溫度下的 生長曲線。1、將酵母菌(釀酒酵母ZM1-5或安琪酵母AQ)過夜培養，檢測菌液的0D_值。2、按0D_ = 0.01終濃度將菌液接入YPD液體培養基(pH4. 5)中，分別不同溫度 (281、321、351、371、401或42°0、180卬111培養72 小時，分別在 4h、16h、22h、28h、48h、 68h取樣，檢測菌液的0D_值。設置三次重復試驗，結果取平均值。ZM1-5與AQ在不同溫度條件下的生長曲線比 較見圖11。兩者于22h基本達到穩定期，22h之后安琪酵母AQ在32°C時的生長曲線趨于平 穩，而釀酒酵母ZM1-5在22h后仍趨于緩慢生長階段。兩株菌均在32°C時生長最快，菌量最 多。在42°C，釀酒酵母ZM1-5存活能力明顯高于安琪酵母AQ，說明釀酒酵母ZM1-5比安琪 酵母AQ有更強的耐受高溫的能力。實施例5、釀酒酵母ZM1-5與安琪酵母AQ發酵葡萄糖的比較將酵母菌菌液(釀酒酵母ZM1-5或安琪酵母AQ)接入IOOmL的YPD+20% Glu液體培養基，接種量為1.5X107個/mL(終濃度)，分別置于不同溫度(32°C、37°C、40°C或42°C) 下發酵，發酵72h后取發酵液測酒精度(酒份)。酒精度檢測方法取IOOml發酵液加入IOOmL蒸餾水，混勻后加熱蒸餾。收集 IOOmL餾出液，加入蒸餾水IOOmL,混勻，用酒精計測定酒精度，溫度計測定混合液溫度；得 到的值查酒度溫度校正表換算成20°C時的酒精度％ (體積百分含量)，再乘以2，即得發酵 液的酒精度。設置三個重復，結果取平均值。ZM1-5與AQ在不同溫度下發酵葡萄糖72h后的 酒份比較見圖12。釀酒酵母ZM1-5在32°C時酒份達到最高(11. 3% )，37°C時酒份稍低 (10.8% )，40°C時酒份為10. 5%，42°C時酒份為7.4%0安琪酵母AQ，40°C時酒份為9.9%, 42°C時酒份為6. 7%。40°C、42°C時釀酒酵母ZM1-5酒份均顯著高于安琪酵母AQ，說明釀酒 酵母ZM1-5高溫下利用葡萄糖產酒能力比安琪酵母AQ更強。實施例6、釀酒酵母ZM1-5與安琪酵母AQ發酵蔗糖比較將酵母菌菌液(釀酒酵母ZM1-5或安琪酵母AQ)接入IOOmL的YPD+20% Sue液體 培養基，接種量為1.5X107個/mL(終濃度)，分別置于不同溫度(32°C、37°C、40°C或42°C) 下發酵，發酵72h取發酵液測酒精度(酒份)。酒精度檢測方法同實施例5。設置三個重復，結果取平均值。ZM1-5與AQ在不同溫度下發酵蔗糖72h后的酒份 比較見圖13。兩個菌株均是在32°C發酵時酒份最高，37°C、40°C時酒精產量稍低。42°C時， 釀酒酵母ZM1-5的酒份顯著高于安琪酵母AQ，說明了釀酒酵母ZM1-5高溫下利用蔗糖產酒 能力比安琪酵母AQ更強。實施例7、釀酒酵母ZM1-5與安琪酵母AQ利用木薯粉液化醪發酵產酒精比較木薯粉液化醪廣西中糧生物質能源有限公司，每IOOmL醪液含27g總糖。1、將酵母菌(釀酒酵母ZM1-5或安琪酵母AQ)在YPD液體培養基中28°C、180rpm 搖床培養約24h，使活菌濃度達到OD6tltl = 2. 0以上，于顯微鏡下血球計數板計算菌液濃度。2、分別按1. 5 X IO7個細胞/mL，2. OXlO7個細胞/mL，2. 5 X IO7個細胞/mL的接種 量(終濃度)將菌液接入9個裝有500mL木薯粉液化醪的IL三角瓶中(每個接種量3瓶)， 32°C培養70小時，得到發酵液。3、測定發酵液中各種成分(酒精，活菌數、殘總糖、殘還原糖)的含量。酒精度檢測方法同實施例5。活菌數檢測方法(平板計數法)以10倍為梯度稀釋發酵液，各梯度取100 μ 1涂 布YPD平板三塊，32°C恒溫培養2-3天，依次觀察涂布各個稀釋液的平板，用涂布最大稀釋 度的稀釋液且有單菌落生長的平板進行計算，計算生長的單菌落個數(能生長菌落的最大 稀釋度的平板上)；計算公式活菌數/ml =(三塊平板上生長的單菌落個數/3) XlOX稀
釋倍數。殘總糖的測定①取ImL發酵液加入5mL ddH20、ImL濃鹽酸；②于沸水中反應 20min后于冷水中冷卻；③加入一滴酚酞，并用4M NaOH水溶液滴至微紅，最后將溶液定容 至IOOmL,得到反應液；④取400 μ L的反應液加入800 μ L DNS溶液(四水合酒石酸鉀鈉 200g，氫氧化鈉10g，無水亞硫酸鈉0. 5g，結晶酚2g，DNS 10g，蒸餾水1L，室溫避光靜置7天 后可用)，沸水浴5min后冷水冷卻，取200 μ L于酶標板，OD540處測值；⑤所得的值代入葡萄 糖標準曲線即得還原糖的量(殘總糖的量)。
殘還原糖的測定①取ImL發酵液加入19mL ddH20,混勻；②取400 μ L混勻液加 入800 μ L的DNS溶液，沸水浴煮5min后冷水冷卻，取200 μ L于酶標板，OD540處測值；③所 得的值代入葡萄糖標準曲線即得還原糖的量(殘還原糖的量)。實驗設置三次重復，結果取平均值。結果見圖14。在接種量為2. 0X IO7個/mL時，釀酒酵母ZM1-5發酵的酒份最高，達到15. 2%，比 安琪酵母 AQ 高 0. 8% (t-test, ρ < 0. 05)。在各個接種量，釀酒酵母ZM1-5的活菌數均比安琪酵母AQ顯著高；在接種量為
1.5X IO7個細胞/mL并經過70小時的發酵后，釀酒酵母ZM1-5增殖到3. 20X IO8個/mL活 菌濃度；說明釀酒酵母ZM1-5在濃醪、高酒精環境下能較好地存活。釀酒酵母ZM1-5與安琪酵母AQ在接種濃度為2. OX IO7個細胞/mL時的殘總糖 量比其它兩個接種量低，說明接種量為2. OX IO7個細胞/mL時發酵效果最好；在接種量為
2.OX IO7個細胞/mL時，釀酒酵母ZM1-5的殘總糖量和殘還原糖量分別比安琪酵母AQ低 0. 2g/100mL和 0. 09g/100mL。實施例8、釀酒酵母ZM1-5與安琪酵母AQ利用甘蔗汁發酵產酒精比較1、將酵母菌(釀酒酵母ZM1-5或安琪酵母AQ)在YPD液體培養基中28°C、180rpm 搖床培養約24h，使活菌濃度達到OD6tltl = 2. 0以上。2、取IOmL步驟1的菌液接入裝有IOOmL甘蔗汁(新鮮糖蔗壓榨取得，總糖含量為 18% )的250mL三角瓶中，分別置于不同溫度(32°C、37°C、40°C、或42°C )下培養70小時， 得到發酵液。3、取IOmL步驟1的菌液接入裝有IOOmL滅菌甘蔗汁(新鮮糖蔗壓榨取得，總糖含 量為18%，分裝三角瓶后121°C滅菌20分鐘)的250mL三角瓶中，分別置于不同溫度(32°C、 37°C、40°C、或42°C )下培養70小時，得到發酵液。4、測定步驟2和步驟3的發酵液的二氧化碳失重以及發酵液中各種成分(酒精、 殘總糖)的含量。二氧化碳失重發酵前后發酵液的重量差即二氧化碳失重(g)。酒精度檢測方法同實施例5。殘總糖的測定方法①取ImL發酵液加入3mL ddH20和ImL的濃鹽酸； ②66°C -68°C反應IOmin后于冷水中冷卻；③加入一滴酚酞，并用4M NaOH水溶液滴至微 紅，最后將溶液定容至10mL，得到反應液；④取400 μ L反應液加入800 μ L的DNS溶液；⑤ 沸水浴煮5min后冷水冷卻，取200 μ L于酶標板，OD54tl處測值；⑥所得的值代入葡萄糖標準 曲線即得還原糖的量(殘總糖的量)。實驗設置三次重復，結果取平均值。釀酒酵母ΖΜ1-5與安琪酵母AQ發酵甘蔗汁產 物結果分析見圖15。滅菌后的甘蔗汁酒精發酵，釀酒酵母ΖΜ1-5與安琪酵母AQ的酒精產量 在32°C時相當(10. )，釀酒酵母ZM1-5在37°C (10·3%)和42°C (7. 1% )時的酒精產 量均高于AQ的(10%，6. 5%) ；40°C和42°C時釀酒酵母ZM1-5的殘總糖含量比AQ的低。在 新鮮甘蔗汁的酒精發酵中，釀酒酵母ZM1-5在32°C時酒份為10. 1%、42°C時酒份為7. 6%， 安琪酵母AQ在32°C時酒份為9. 6%、42°C時酒份為7%，釀酒酵母ZM1-5的酒份均比安琪酵 母AQ的高；32°C和37°C時，釀酒酵母ZM1-5與安琪酵母AQ的殘總糖含量都相當低；40°C和 42°C時，釀酒酵母ZM1-5殘總糖含量低于安琪酵母AQ的。新鮮蔗汁發酵中，釀酒酵母ZM1-5的CO2失重在42°C顯著高于安琪酵母AQ的。結果表明，釀酒酵母ZM1-5在新鮮蔗汁中發酵 比在滅菌蔗汁中發酵效果好，且殘糖含量低，如果應用于實際生產，將可以節省大量能源。實施例9、釀酒酵母ZM1-5與安琪酵母AQ利用糖蜜發酵產酒精比較1、糖蜜與自來水1 2體積比稀釋、混勻，pH調至4.0，即為糖蜜培養基。2、將酵母菌(釀酒酵母ZM1-5或安琪酵母AQ)在YPD液體培養基中28°C、180rpm 搖床培養約24h，使活菌濃度達到OD6tltl = 2. 0左右。3、取IOmL菌液接入含IOOmL糖蜜培養基的250mL三角瓶中，分別置于不同溫度 (321、371、401或421)培養70小時，得到發酵液。4、測定步驟3的發酵液的二氧化碳失重以及發酵液的酒精度。二氧化碳失重發酵前后發酵液的重量差即二氧化碳失重(g)。酒精度檢測方法同實施例5。實驗設置三次重復，結果取平均值。ZM1-5與AQ在不同溫度下發酵甘蔗糖蜜結果 分析見圖16。釀酒酵母ZM1-5在不同溫度下的酒精度和二氧化碳失重均明顯比安琪酵母 AQ高，說明它可以糖蜜為底物進行發酵，且發酵結果較安琪酵母AQ好。
權利要求
釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZM1 5，它的保藏編號為CGMCC No.3761。
2.權利要求1所述釀酒酵母ZM1-5在生產酒精中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于應用所述釀酒酵母ZM1-5時，pH值為3-9， 溫度為28-42°C ；應用所述釀酒酵母ZM1-5時，pH值優選為4_5 ；應用所述釀酒酵母ZM1-5 時，溫度優選為28-40°C，溫度最優選為32°C。
4.一種生產酒精的方法，包括如下步驟發酵權利要求1所述釀酒酵母ZM1-5，得到酒Ib ο
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于所述方法中，用于發酵的底物為葡萄糖和/ 或蔴糖。
6.如權利要求4所述的方法，其特征在于所述方法中，用于發酵的底物為木薯、糖蜜 和甘蔗汁中的至少一種。
7.如權利要求4或5或6所述的方法，其特征在于所述發酵的溫度為32°C至42°C。
8.如權利要求4至7中任一所述的方法，其特征在于所述發酵起始時，權利要求1所 述釀酒酵母ZM1-5在發酵體系中的濃度為1. 5 X IO7至2. 5 X IO7個細胞/mL。全文摘要
本發明公開了一株釀酒酵母菌株及其應用。本發明提供了釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)ZM1-5 CGMCC No.3761。釀酒酵母ZM1-5可用于生產酒精。酵母菌株ZM1-5具有生長快、酒精產量高、耐高溫、耐高糖、耐高濃度乙醇和耐酸等多個優點，可應用于以木薯粉、糖蜜和甘蔗汁等為原料的濃醪發酵產酒精工藝(同步糖化發酵)中，解決工業生產中酵母菌不能耐受高滲透壓、高濃度乙醇和發酵后期效率低等問題，降低酒精工業生產的成本。酵母菌株ZM1-5用于同步糖化發酵產酒精工藝中，有望解決濃醪發酵中底物濃度高(滲透壓高)、發酵罐內溫度高、發酵后期酵母菌受高濃度酒精抑制等問題。
文檔編號C12R1/865GK101962620SQ20101051266
公開日2011年2月2日 申請日期2010年10月13日 優先權日2010年10月13日
發明者馮家勛, 羅雪梅 申請人:廣西大學