一種釀酒酵母及其應用的制作方法

專利名稱：一種釀酒酵母及其應用的制作方法
一種釀酒酵母及其應用技術領域
本發明屬于微生物技術領域，具體而言，涉及一株合成谷胱甘肽能力較強的釀酒酵母 i^acclmromyces cerevisiae)及其應用。
背景技術：
谷胱甘肽，gp Y-L-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸，是微生物細胞內最豐富的非蛋白巰基化合物，由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸經肽鍵縮合而成，同時具有Y -谷氨酰基和巰基。GSH廣泛存在于自然界的生物體中。在生物體內，GSH有著多種重要的生理功能， 主要為三個方面，如抗氧化、增強免疫和解毒。第一，對于維持生物體內適宜的氧化還原環境，GSH起著至關重要的作用。第二，增強免疫，在高等真核細胞中，GSH可以迅速增強機體的免疫力。第三，作為解毒劑，GSH長被用于與其它物質組合構成治療或保健藥物。近年來， 日本科學家發現GSH具有抑制艾滋病病毒的功效。谷胱甘肽在醫學、食品、化妝品等領域具有廣泛的市場前景。
谷胱甘肽的生產方法主 要有萃取法、化學合成法、酶法和發酵法。其中發酵法是最具潛力的方法。日本在20世紀80年代已經實現了 GSH的工業化生產，我國發酵法生產谷胱甘肽起步較晚，目前仍停留在實驗室試驗階段，GSH發酵過程中發酵水平不高以及下游分離純化相關技術未取得實質性突破，使得谷胱甘肽的工業化生產在我國一直未能實現。由于谷胱甘肽在水溶液中極易被氧化，因此微生物細胞合成的谷胱甘肽一般存在于細胞中。酵母是谷胱甘肽合成最具潛力的微生物，且酵母富含蛋白質，在食品和醫藥工業中具有廣泛的用途。生產谷胱甘肽含量高的酵母既能作為食品和醫藥工業的原料，同時也可以提供豐富的功能性成分谷胱甘肽，對改善人體機能具有非常重要的作用。發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種合成谷胱甘肽能力較強的菌株和富含谷胱甘肽的干酵母產品，有效解決微生物中酵母合成產率低及谷胱甘肽干酵母中谷胱甘肽含量低的問題，拓寬富含谷胱甘肽干酵母的應用范圍，提高產品附加價值。
為了實現本發明，發明人通過大量試驗反復進行菌種選育研究，并終于獲得了一株合成谷胱甘肽能力較強的釀酒酵母iSaccharomyces cerevisiae)CCCG,已于2012年6月 11日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO.M2012215。
形態學特征菌落白色，無光澤，扁平，呈草帽形，表面及邊緣粗糙，邊緣不整齊，濕潤粘膩，不容易挑起；正反面，邊緣與中央部位顏色一致。
生理特性不僅可利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、糖蜜等碳源，還可利用可溶性淀粉作為碳源；具有硫酸鋅抗性標記。
代謝特性代謝過程能積累產生谷胱甘肽本發明的涉及的高產谷胱甘肽的釀酒酵母iSaccharomyces cerevisiae ) CCTCC No. M2012215是按照如下方法獲得的親本為親株A :釀酒酵母cerevisiae CICC1251,親株B :熱帶假絲酵母Candida tropicalis CICC31709,實驗室保藏菌株。原生質體的制備將待融合的親株A和親株B在斜面培養基上活化兩次(斜面培養基葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，瓊脂20 g/L，pH6. 0,0.1MPa滅菌15min)，活化后接入搖瓶培養基(搖瓶培養基葡萄糖20 g/L, (NH4) 2S045 g/L，KH2PO4 I g/L, NaCl O.1 g/L, MgSO4O. 5 g/L, CaCl2 0.1 g/L，酵母粉 0. 2 g/L，0.1MPa 滅菌 15min)培養至對數生長期，5000rpm下離心收集細胞，將細胞懸浮于I mL無菌脫壁預處理液(O. 05mo I/L EDTA溶液與O. 1% β-巰基乙醇混合，用O. lmol/L檸檬酸緩沖液配制(O. lmol/L檸檬酸4. 7ml,O. lmol/L檸檬酸鈉15. 3ml混合，pH5. 8),0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌，)中，使細胞數為IO7個/mL，30°C振蕩處理15 min，5000rpm下離心收集細胞；用1% (W/V)蝸牛酶加1% (W/V)纖維素酶(1%蝸牛酶和1%纖維素酶的配制方法用O. lmol/L檸檬酸緩沖液加0. 7mol/L KCl的高滲溶液配制，然后通過0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌)復合酶酶解懸浮預處理過的細胞，30°C振蕩處理40 60 min ;當原生質體形成率達到90%以上后，力口入 4 mL 無菌 Tris-HCl 高滲緩沖液(Tris-HCl 高滲緩沖液0. 05mol/L Tris_HCl，pH 7. 4 (50mL0.1 mol/L三羥甲基氨基甲烷溶液與42mL 0.1 mol/L鹽酸均勻混合后加水稀釋至100 mL)，0.5mol/L鹿糖，0.05 mol/L CaCl2，然后通過0. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌)停止酶解，將離心管上下倒置兩次，搖勻后在轉速3000 rpm離心5 min收集酶解后的細胞，將收集的細胞用2 mL無菌Tris-HCl高滲緩沖液懸浮，得親株A、親株B的原生質體。
原生質體融合上述方法制得的原生質體，以1:1的比例各取親株A、親株B的原生質體液0.1 mL混合后加入0.8 mL無菌Tris-HCl高滲緩沖液，離心去上清液；然后，加入2mL促融劑溶液(促融劑配置方法PEG6000(聚乙二醇)30 g，溶于100 mL Tris-HCl高滲緩沖液，0. 22 μπι微孔濾膜過濾除菌)，輕搖混合，30°C靜置保溫I h ；3000 rpm離心，收集沉淀，用液體高滲基本培養基(液體高滲基本培養基(g/L):葡萄糖20，(NH4)2SO4 5，KH2PO41，NaCl 0.1 , MgSO4 0. 5, CaCl2 0.1,酵母膏 0.2，蔗糖 170，0.1MPa 滅菌 15min)洗滌兩次，將沉淀再懸于液體高滲基本培養基中；取0.1 mL液體高滲基本培養基菌懸液于4mL高滲基礎培養基軟瓊脂(上層)(高滲基礎培養基軟瓊脂(g/L):葡萄糖20，(NH4)2SO4 5，KH2PO4 1，NaCl 0.1 , MgSO4 0. 5，CaCl2 0.1，酵母膏 0.2，蔗糖 170，瓊脂 10 0.1MPa滅菌15min)中，搖勻迅速倒入底層為高滲基礎固體培養基(高滲基礎固體培養基(g/L):葡萄糖 20，(NH4)2SO4 5，KH2PO4 1，NaCl 0.1 , MgSO4 0. 5，CaCl2 0.1，酵母膏 0. 2，蔗糖170，瓊脂20 0.1MPa滅菌15min)的平板上，30°C培養4 5天。挑出平板上的單菌落，接入基礎固體培養基(基礎固體培養基(g/L):葡萄糖20，(NH4)2SO4 5，KH2PO4 1，NaCl0.1 , MgSO4 0. 5，CaCl2 0. 1，酵母膏0. 2，瓊脂20 0.1MPa滅菌15min)的斜面試管，保藏備用。融合子的篩選將上述保藏菌株接入到在淀粉選擇平板(淀粉選擇平板培養基淀粉 20，(NH4)2SO4 5，KH2PO4 1，NaCl 0.1 , MgSO4 0. 5，CaCl2 0.1，酵母膏 0.2，瓊月旨20 0.1MPa滅菌15min)上，經過兩次淀粉選擇平板的篩選，得到融合較好的菌株R2和R7(實驗室編號，下同)。通過搖瓶發酵(搖瓶發酵培養基(g/L):葡萄糖20，(NH4)2SO4 5，KH2PO4 1，NaCl0.1 ,MgSO4 0. 5, CaCl2 0.1，酵母膏 0. 2，0.1MPa 滅菌 15min)試驗，R7 的谷胱甘肽(GSH)產量比R2高，選用R7作為下一步試驗菌株。同時，對R7進行穩定性檢驗，經斜面連續傳代10次，R7的GSH合成能力基本不變，說明本試驗獲得的融合子R7有較好的遺傳穩定性。對融合菌株R7采用亞硝酸誘變，篩選有硫酸鋅抗性的GSH高產突變株。將菌株R7接種于搖瓶發酵培養基(搖瓶發酵培養基(g/L):葡萄糖20，(NH4)2SO4 5，KH2PO4 1，NaClO.1 , MgSO4 O. 5，CaCl2 O.1,酵母膏 O. 2，O.1MPa 滅菌 15min)中，在 30°C，150 轉 / 分鐘條件下培養至對數生長期，離心收集菌體，以3倍體積的無菌水洗滌，將菌體制成細胞量約為IO7個/ml的菌懸液；取菌懸液lml，加入lmol/L ρΗ4· 5醋酸緩沖液(lmol/L ρΗ4· 5醋酸緩沖液制備方法稱取醋酸6. 12g，加蒸餾水定容至100ml。稱取醋酸鈉8. 2g，加蒸餾水定容至100ml。將醋酸鈉溶液緩緩加入到醋酸溶液中，攪拌均勻，調節pH至4. 5，兩者之比大約為I I。)及O. lmol/L亞硝酸鈉溶液，于30°C保溫20min ;加入O. 07mol/L、pH8. 6的磷酸氫二鈉緩沖液(稱取磷酸氫二鈉(Na2HP042H20)1. 246g，加蒸餾水定容至100ml。)20ml，使PH下降至6. 8左右，以終止反應；將誘變后的菌懸液稀釋后涂布在7. 5mmol/L濃度的硫酸鋅平板上，挑選平板上生長的菌落保藏，即為硫酸鋅抗性突變菌株。對所有硫酸鋅抗性突變菌株進行初篩(將硫酸鋅抗性突變株接入斜面培養基(斜面培養(g/L):葡萄糖20，蛋 白胨20，酵母膏10，瓊脂20 pH6. 0,0.1MPa滅菌15min)，培養2 3天后將菌株接入搖瓶培養基(搖瓶培養基(g/L):葡萄糖 20，(NH4)2SO4 5，KH2PO4 1，NaCl O.1 , MgSO4 0.5，CaCl2 0.1，酵母膏O. 2，O.1MPa滅菌15min)，培養24h后測各菌株的GSH含量，選取GSH含量提高的菌株進行復篩。)和復篩(將初篩菌株從斜面培養基上活化，再接至種子培養基(種子培養基(g/L):葡萄糖 20, (NH4)2SO4 5，KH2PO4 1，NaCl O.1 , MgSO4 O. 5，CaCl20.1，酵母膏O. 2，O.1MPa滅菌15min)，培養12h后，以10%的接種量接入發酵培養基(發酵培養基(g/L):葡萄糖 20, (NH4)2SO4 5，KH2PO4 1，NaCl O.1 , MgSO4 O. 5，CaCl2 O.1,酵母膏O. 2,0.1MPa滅菌15min)發酵，每株3瓶，培養48h后測各菌株的谷胱甘肽含量，根據谷胱甘肽含量確定谷胱甘肽高產菌株。)。經過初篩和復篩，編號為CCCG的突變株谷胱甘肽含量最高，經鑒定，該菌株為釀酒酵母cerevisiae"),命名為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CCCG，在中國典型培養物保藏中心的專利保藏編號為CCTCC:M2012215。利用本發明的菌株可以富含谷胱甘肽的食品、藥品或化妝品。例如，利用本發明的菌株制備富含谷胱甘肽干酵母的方法如下
I)將釀酒酵母cerevisiae、CCTCC:M2012215接種到種子培養基中，28-32°C培養 36-48 小時，搖床轉速 180-200 rmp/min。2)搖瓶水平上發酵將步驟I)的菌液接種至發酵培養基中，接種量8%_10% (V/V), 28-32°C培養56-64小時，在培養18-20小時時，一次性添加前體氨基酸和ATP (谷氨酸8-12mmol/L,半胱氨酸 8-12 mmol/L,甘氨酸 5-7 mol/L, ATP1. 6-1. 7 mg/L),得到還原型大于98%，胞內含量4%-4. 5%的還原型谷胱甘肽。3)放大到30L發酵罐通過分階段控制流加發酵培養基策略，利用糖蜜和葡萄糖兩種碳源，發酵溫度28-32°C，攪拌轉速100-600 rmp/min，通氣量5_30 L/min，在生物量達到一定時，一次性添加前體氨基酸和ATP (谷氨酸25-35 mmol/L,半胱氨酸5_35 mmol/L,甘氨酸15-20 mol/L, ATP 3-8 mg/L)，調節轉速和通氣量，分階段控制發酵罐的溶氧水平。并流加20 mL/h-50 mL/h碳源，繼續發酵20-24小時。
4)富含谷胱甘肽的干酵母生產將3)中得到的發酵液，在3000-5000 rmp條件下，離心3-5min分鐘，并用蒸餾水反復洗滌離心，得到干凈菌體，再配置成一定濃度的酵母液，在噴霧干燥塔中，控制進風溫度130-150°C，得到到干物質含量在90%-95%、胞內谷胱甘肽含量在3. 5-4. 5%的酵母干菌體。
所述以硫酸鋅抗性為篩選標記所選用的抗性標記不僅僅局限于硫酸鋅，同時包括氯化鋅，硝酸鋅等鋅鹽中的一種或幾種的組合。
所述對融合子R7進行亞硝酸誘變，其中亞硝酸包含亞硝酸和亞硝酸的各種鹽的一種或者幾種。
所述篩選到一株具有硫酸鋅抗性的突變株釀酒酵母{Saccharomyces cerevisiae ) CCTCC:M2012215，所獲得的抗性包含所有的鋅鹽。
所述搖瓶水平上發酵，一次性添加前體氨基酸和ATP，其中的最佳組合為谷氨酸 10mmol /I,,半胱;氛酸 10mmol /I,,甘氛酸 6mol/L, ATP1. 67mg/L。
所述通過分階段控制流加發酵培養基策略，利用糖蜜和葡萄糖兩種碳源，包含兩者中的一種或者兩者的各種組合配比，以及各種流加策略。
所述放大到30L發酵罐，一次性添加前體氨基酸和ATP的最適組合為谷氨酸 30mmol/L,半胱;氛酸 30mmol/L,甘氛酸 18mol/L, ATP 5mg/L。
所述分階段控制發酵罐的溶氧水平，包含的手段為調節轉速和通氣量中的一種或者兩種。
所述流加少量碳源，繼續發酵20-24小時，其中少量碳源為如下的一種或幾種的組合含糖量29%的糖蜜(6 L)，含糖量29%的葡萄糖(4 L)，硫酸銨264 g和磷酸二氫銨 40g。
所述在噴霧干燥塔中，控制進風溫度，為130-150°C。
具體地，本領域技術人員可參考以下具體發酵過程進行發酵培養Cl)菌株釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CCTCC:M2012215。
(2)培養基每I L所述斜面培養基含有葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母粉5 g，瓊脂20 g，所述斜面培養基PH 5. 8-6. 2 ；每I L所述搖瓶水平上發酵培養基含有葡萄糖25. 95 g，酵母粉11. 47 g，硫酸銨 10. 16 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂O. 2 g，所述發酵培養基pH 5. 5-6. O ；每I L所述發酵罐水平上發酵培養基含有水9 L，酵母粉100 g,所述發酵液pH 5. 5~6. O ；流加發酵培養基含糖量29%的糖蜜(6 L)，含糖量29%的葡萄糖(4 L)，硫酸銨264 g， 磷酸二氫銨40 g ；(1)種子擴大培養斜面種子活化12-16小時后接入裝入種子培養基的三角瓶中培養，裝液量25-30 mL, 12-18小時即得一級種子；之后再按5-10% (10%為體積比)的接種量將一級種子接入相同發酵培養基培養12-18小 時制備二級種子，培養溫度28-32°C，轉速180-200rpm/min ；(2)發酵具體包括以下步驟將二級種子按5-10%的接種量接入發酵罐中，在全自動發酵罐中，至少發酵44h，發酵溫度28-32°C，攪拌轉速100-600rmp，通氣量5_30L/min，在生物量達到一定時，一次性添加前體氨基酸，(谷氨酸30mmol/L,半胱氨酸30mmol/L,甘氨酸18mol/L,ATP 5mg/L),調節轉速和通氣量，分階段控制發酵罐的溶氧水平。并繼續流加20mL/h-50mL/h碳源，得到還原型大于98%，胞內含量4%-4. 5%的還原型谷胱甘肽。本發明涉及的釀酒酵母cerevisiae)CCTCCNo. M2012215 具有如下優點和顯著的進步
(1)酵母的胞內谷胱甘肽含量高達35-45mg/g，有效解決微生物中酵母合成產率低及谷胱甘肽干酵母中谷胱甘肽含量低的問題，拓寬富含谷胱甘肽干酵母的應用范圍。對面團改 良效果好，解決了單獨添加谷胱甘肽的改良面團存在的成本高及極易被氧化等問題，提高了產品附加價值。(2)在搖瓶水平上發酵培養后的谷胱甘肽產量為175 mg/L-600 mg/L，在30 L發酵罐上采用變速流加發酵培養后的谷胱甘肽產量為1500 mg/L-2000 mg/L，在60立方發酵罐上采用變速流加發酵培養后的谷胱甘肽產量為1000 mg/L-2000 mg/L。(3)發酵培養后的酵母無需進行谷胱甘肽的提取和純化，還原型谷胱甘肽直接和酵母細胞一齊使用，通過細胞保護作用減少谷胱甘肽的氧化。由于不需要進行谷胱甘肽的提取和純化，因此不存在谷胱甘肽的損失問題，產品的活性損失也小。
具體實施例方式以下通過實施例形式對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明，但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。實施例一菌種的選育 Cl)菌株
釀酒酵母 SscchaxomycGS cereFi^iaeCICC1251,熱帶假絲酵母 Candidatropical isClCC ,nQ9
(2)培養基
每I L所述斜面培養基含有葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母粉10 g，瓊脂20 g，所述斜面培養基pH自然；
每I L所述種子培養基含有葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母粉10 g，所述斜面培養基PH自然；
每I L所述搖瓶上發酵培養基含有葡萄糖20 g，酵母粉5 g，(NH4)2SO4 7.5 g，KH2PO4 3 g，MgSO4 O. 15 g。所述發酵培養基 ρΗ5· 5_6· O ;
每I L所述基本培養基含有葡萄糖20 g, (NH4)2SO4 5 g，KH2PO4 I g，NaCl O.1 g，MgSO4O. 5 g, CaCl2 O.1 g，酵母粉 0. 2 g，瓊脂 20 g，0.1MPa 滅菌 15min ；
每IL所述高滲基本培養基含有基本培養基中加入蔗糖使其終濃度為170g/L ；
每IL所述選擇培養基含有基本培養基中以2%的可溶性淀粉為唯一碳源。(3)實驗中所用到的溶液 ①O. lmol/L檸檬酸緩沖液(CB)O. lmol/L 朽1 樣酸 4. 7 mL, O. lmol/L 梓樣酸納 15. 3 mL 混合，ρΗ5· 8。②脫壁預處理劑O. 05mol/L EDTA溶液與O. 1% β -巰基乙醇混合，用CB配制，O. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌。③酶液1%蝸牛酶，1%纖維素酶，均用CBK溶液配制，O. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌。④Tris-HCl高滲緩沖液(CTC)O. 5mol/L 蔗糖，O. 01mol/L (pH 7. 4),0. 05mol/L CaCl20⑤促融劑(PTC)PEG6000 30 g，溶于100 mL CTC溶液，O. 22 μ m微孔濾膜過濾除菌
(4)種子培養斜面種子活化12-16小時后，接入裝入25 mL種子培養基的250 mL三角瓶中培養12-18 小時，轉速200rpm/min即得一級種子。
(5)發酵培養 將一級種子接入25 mL/250mL搖瓶中，在28°C-30°C、轉速180 rmp-200 rmp的條件下培養60 ho
(6)原生質體形成過程對Log酵母進行酶解前預處理用EDTA加0. 1%β -巰基乙醇懸浮菌體，30°C保溫15min 預處理，再加入1%蝸牛酶+1%纖維素酶復合酶處理60min，原生質體形成率為76. 24%。對假絲酵母不進行預處理，直接加入1%蝸牛酶+1%纖維素酶復合酶處理90min去除細胞壁， 原生質體形成率為91. 67%。
(7)原生質體的制備與再生將待融合的菌株活化兩次，活化后接入搖瓶培養基培養至對數生長期，收集對數生長期的細胞；將細胞的濃度調整為IO7個/mL ;將細胞懸浮于I mL脫壁預處理液中，30°C振蕩處理15 min，離心，收集細胞；用適當的酶液懸浮預處理過的細胞，30°C振蕩處理40 60 min,隨時用顯微鏡觀察原生質體的形成情況；原生質體形成率達到90%以上后，加入4 mLCTC溶液停止酶解，將離心管上下倒置兩次，搖勻后在轉速3000 rpm，離心時間5 min的條件下收集酶解后的細胞，將收集的細胞用2 mLCTC溶液懸浮；將酶解后的細胞懸液適當稀釋后，涂布于高滲基本培養基平板；培養3 4天，記錄菌落數。計算原生質體的再生率。
(8)原生質體融合上述方法制得的原生質體，以1:1的比例各取原生質體液0.1 mL混合后加入 0. 8mLCTC,離心去上清液；然后，加入2 mL促融劑PTC溶液，輕搖混合，30°C靜置保溫Ih ;接著離心，用液體高滲培養基洗滌兩次，將沉淀再懸于其中；最后，取0.1 mL處理液于高滲基礎培養基軟瓊脂(上層)4 mL中，搖勻迅速倒入底層為高滲基礎培養基的平板上，30°C培養 4 5天。
(9)融合子的篩選將上述融合子接入到在淀粉選擇平板上，經過兩次淀粉選擇平板的篩選，得到融合較好的菌株R2和R7。經過發酵試驗，R2 GSH產量為67. 93 mg/L，R7的GSH產量為76. 59 mg/ L。因此，選用R7作為下一步試驗菌株。同時，對R7進行穩定性檢驗，經斜面連續傳代10次，R7的GSH含量下降了 5. 89%，GSH產量下降7. 73%，說明本試驗獲得的融合子R7有較好的遺傳穩定性。(10)誘變選育
對融合菌株R7采用亞硝酸誘變，選用添加硫酸鋅的平板篩選GSH高產突變株。將待誘變的菌懸液，稀釋后涂布在7. 5 mmol/L濃度的硫酸鋅平板上。對菌株進行初篩和復篩，再經過發酵試驗，其中突變株CCCG的GSH產量最高，為125. 36 mg/L。經鑒定，為釀酒酵母。專利保藏編號CCTCC:M2012215。將該菌株作為以后的試驗菌株。實施例二 在搖瓶水平上發酵培養 Cl)菌株
釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CCCG,保藏號 CCTCC:M2012215。
(2)培養基
每IL所述斜面培養基含有葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母膏5g，瓊脂20g，所述斜面培養基 ρΗ5· 8-6. 2 ；
每IL所述種子培養基含有葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母膏5g，所述斜面培養基ρΗ5· 8~6. 2 ；
每IL所述搖瓶上發酵培養基含有葡萄糖25. 95g，酵母粉11. 47g，硫酸銨10. 16g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂O. 2g，所述發酵培養基pH5. 5-6. O ；
(3)種子培養
斜面種子活化12-16小時后，接入裝入25mL種子培養基的250mL三角瓶中培養12-18小時，轉速200rpm即得一級種子；
(4)發酵培養
將一級種子接入25mL/250mL搖瓶中，在28°C _30°C、轉速180rmp-200rmp的條件下培養 50-60h。
(5)胞內谷胱甘肽的提取
取一定體積的菌液于離心管中，5000rpm離心IOmin收集菌體，蒸餾水洗滌兩次后，用蒸餾水懸浮，搖勻后放入冰箱冰凍過夜，將冰凍的菌體在95 100°C條件下水浴lOmin，取出后在冰水中速冷，5000rpm離心lOmin，上清液作為測試樣品。
(6)細胞干重的測定
一定的發酵液離心后用蒸餾水洗滌2次，得到的新鮮細胞在105°C烘干至恒重。
(7)谷胱甘肽含量的測定 采用碘量法。
(8)結果
發酵時間=50-60小時；細胞干重:5-15 g/L ；
胞內谷胱甘肽含量35-40 mg/g ;谷胱甘肽產量175 mg/L-600 mg/L ；實施例三在30 L發酵罐上采用變速流加發酵培養 Cl)菌株
釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CCCG,保藏號 CCTCC:M2012215。
(2)培養基
每I L所述斜面培養基含有葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母粉5 g，瓊脂20 g， 所述斜面培養基PH 5. 8-6. 2 ；每I L所述種子培養基含有葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母粉5 g，所述斜面培養基 pH 5. 8~6. 2 ；每IL所述搖瓶上發酵培養基含有葡萄糖25. 95 g，酵母粉11. 47 g，硫酸銨10. 16 g， 磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂O. 2 g，所述發酵培養基pH 5. 5-6. O ；每IL所述發酵罐水平上發酵培養基含有水9L，酵母粉100 g,所述發酵培養基 ρΗ5· 5-6. O ；流加發酵培養基含糖量29%的糖蜜(6 L)，含糖量29%的葡萄糖(4 L)，硫酸銨264 g， 磷酸二氫銨40 g ；(3)種子培養斜面種子活化12-16小時后，接入裝入25 mL種子培養基的250 mL三角瓶中培養12-18 小時即得一級種子；之后再按10% (10%為體積比)的接種量將一級種子接入相同發酵培養基培養12-18小時制備二級種子，培養溫度28-32 °C，恒溫培養振蕩器，轉速200rpm/min ；(4)發酵培養基變速流加發酵將準備好的二級種子按10%的接種量接入裝有9 L底水的全自動發酵罐中，發酵溫度28-32 °C，攪拌轉速100-600 rmp，通氣量5_30 L/min。通過控制碳源和氮源的流加速度(碳源流加速度10 mL/h-600 mL/h，氮源流加速度10 mL/h-50 mL/h)，同時發酵液中酒精的含量控制在O. 1%-0. 5% (W/V)，使菌體在較短時間內達到較高水平。在生物量達到一定時，一次性添加前體氨基酸，維持一定的轉速和通氣量，并流加20 mL/h-50 mL/ h碳源到發酵結束。 (5)胞內谷胱甘肽的提取取一定體積的菌液于離心管中，5000 rpm離心10 min收集菌體，蒸餾水洗滌兩次后，用蒸餾水懸浮，搖勻后放入冰箱冰凍過夜，將冰凍的菌體在95 100 °C條件下水浴10 min,取出后在冰水中速冷,5000 rpm離心10 min,上清液作為測試樣品。(6)細胞干重的測定一定的發酵液離心后用蒸餾水洗滌2次，得到的新鮮細胞在105°C烘干至恒重。(7)谷胱甘肽含量的測定采用碘量法。(8 ) 結果發酵時間=44-50小時；細胞干重:40-50 g/L ；胞內谷胱甘肽含量35-40 mg/g ;谷胱甘肽產量1500 mg/L-2000 mg/L ；
實施例四在60立方發酵罐上采用變速流加發酵培養Cl)菌株釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) CCCG,保藏號 CCTCC:M2012215。(2)培養基每I L所述斜面培養基含有葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母粉5 g，瓊脂20 g，所述斜面培養基PH 5. 8-6. 2 ；每I L所述一級種子培養基含有葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母粉5 g，所述斜面培養基 pH 5. 8-6. 2 ；每I L所述二級種子培養基含有葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母膏5 g，所述斜面培養基 pH 5. 8-6. 2 ；
每I L所述三級種子培養基含有葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母粉5 g，所述斜面培養基 pH 5. 8-6. 2 ；
每I L所述發酵罐水平上發酵培養基含有水16M3，酵母粉200 kg，所述發酵培養基ρΗ5· 5-6. O ；
流加發酵培養基含糖量29%的糖蜜(10 Μ3)，含糖量29%的葡萄糖(7 Μ3)，硫酸銨528kg,磷酸二氫銨80 kg ； (3)種子培養
斜面種子活化12-16小時后，接入裝入25 mL種子培養基的250 mL三角瓶中培養12-18小時即得一級種子；之后再按10% (V/V)的接種量將一級種子接入相同發酵培養基培養12-18小時制備二級種子，培養溫度28-32 °C，恒溫培養振蕩器，轉速200 rpm ;之后再按10% (V/V)的接種量將二級種子接入相同發酵培養基的2 M3發酵罐中培養12-18小時制備三級種子；
(4)發酵培養基
變速流加發酵將準備好的三級種子全部接入裝有35 M3底水的60 M3發酵罐中，發酵溫度28-32 °C，通氣量800-7000 L/min。通過控制碳源和氮源的流加速度(碳源流加速度40mL/h-2000 mL/h，氮源流加速度25 mL/h-200 mL/h)，同時發酵液中酒精的含量控制在O. 1%-0. 5% (W/V)，使菌體在較短時間內達到較高水平。在生物量達到一定時，一次性添加前體氨基酸，維持500 L/min-1000 L/min的通氣量，并流加50 mL/h-100 mL/h碳源到發酵結束。
(5)胞內谷胱甘肽的提取
取一定體積的菌液于離心管中，5000 rpm離心10 min收集菌體，蒸餾水洗滌兩次后，用蒸餾水懸浮，搖勻后放入冰箱冰凍過夜，將冰凍的菌體在95 100 °C條件下水浴10min,取出后在冰水中速冷,5000 rpm離心10 min,上清液作為測試樣品。
(6)細胞干重的測定
一定的發酵液離心后用蒸餾水洗滌2次，得到的新鮮細胞在105°C烘干至恒重。
(7)谷胱甘肽含量的測定
采用碘量法。
(8)結果
發酵時間=44-50小時；細胞干重:30-45 g/L ；
胞內谷胱甘肽含量35-45 mg/g;谷胱甘肽產量1000 mg/L-2000 mg/L。
權利要求
1.一種釀酒酵母(Saccharomyces cere vi siae) CCCG，其特征在于，它的保藏編號為 CCTCC No. M2012215。
2.權利要求1所述的釀酒酵母CCCG在制備富含谷胱甘肽的食品、藥品或化妝品中的應用。
3.權利要求1所述的釀酒酵母CCCG在制備富含谷胱甘肽的干酵母中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)及其應用，該釀酒酵母的保藏編號為CCTCC NoM2012215，經發酵培養后谷胱甘肽產量高，有效解決微生物中酵母合成產率低及谷胱甘肽干酵母中谷胱甘肽含量低的問題，拓寬富含谷胱甘肽干酵母的應用范圍，提高了產品附加價值。
文檔編號C12R1/865GK102994405SQ20121028712
公開日2013年3月27日 申請日期2012年8月14日 優先權日2012年8月14日
發明者蔡俊, 王常高, 林建國, 胡瑛 申請人:湖北工業大學