耐高溫釀酒酵母及其應用的制作方法
【專利摘要】耐高溫釀酒酵母及其應用，該菌株已在國家知識產權局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2014年7月3日，保藏單位名稱：中國典型培養物保藏中心，保藏編號：CCTCCNO:M2014312。本發明應用離子注入結合高溫馴化技術誘變篩選得到的耐高溫釀酒酵母（ Saccharomycescerevisiae ）NT102002耐高溫40℃，可用于木質纖維素原料同步糖化發酵制備燃料乙醇，為提高釀酒酵母的溫度耐受性提供了新的可行的技術選擇；此技術相對于傳統的誘變育種技術方法簡單，突變率高，所得到的突變株性狀穩定。
CCTCC NO:M2014312
20140703
【專利說明】耐高溫釀酒酵母及其應用
[0001]
【技術領域】
[0002]本發明涉及微生物【技術領域】，具體涉及耐高溫釀酒酵母及其應用。
[0003]
【背景技術】
[0004]近年來，將甘蔗、木薯和纖維素類農林廢棄物等轉化為燃料乙醇已成為解決世界能源危機的一條理想途徑，尤其是利用纖維素類廢棄物轉化生產燃料乙醇得到世界各國政府的支持及廣大科研工作者的普遍關注。在發酵制備纖維素燃料乙醇的過程中，通過糖酵解途徑，酵母菌將葡萄糖轉化為乙醇和二氧化碳，乙醇轉化率可以達到90、5%。然而此路線存在的重要問題之一是:纖維素酶的最適溫度為45?50°C之間，而酵母的最適發酵溫度一般在28?35°C之間，這使得酵母的發酵與纖維素的酶解難以同步進行，因此提高乙醇酵母的最適發酵溫度就成為解決這一問題的關鍵。
[0005]酵母菌的耐熱機制復雜，關系到細胞內多個生理過程的改變以及細胞內部結構的穩定，其中熱休克蛋白、海藻糖、應激糖蛋白大分子等是與菌體耐熱性關系最為緊密的基因。目前提釀酒酵母耐熱性的實驗技術包括高溫馴化、自然選育、誘變育種、原生質體融合育種及基因組改組技術。專利CN 102492634 A從土壤中篩選得到一株耐高溫酵母Ogataeasp.WXT3，能在25?48°C溫度下發酵生產乙醇；專利CN 102041235 A從米酒酒曲中篩選得到一株耐高溫酵母Saccharomyces cerevisiae FE-B,該菌株可以耐受36?44°C的高溫；專利CN103232948 A通過對釀酒酵母進行紫外誘變及基因重排，選育得到 Saccharomyces cerevisiae SY-5-11L,在 38°C條件下乙醇產量為 13.9% (V/V);專利CN 102154138 A利用基因改組技術篩選得到耐高溫、耐酒精、耐酸的高產乙醇酵母突變株TT31，在35°C條件下，以蔗糖為碳源乙醇產量達到101.9g/L。
[0006]由于酵母菌耐熱機制尚未明確，相關基因與耐熱性的關系還需深入研究，應用基因工程技術提高酵母菌的溫度耐受性還有諸多限制。離子注入技術作為一種新型誘變源，以其特殊的物理化學復合誘變效果，已成功應用于許多農作物品種改良和微生物菌種的誘變選育中，并取得了可觀的經濟效益。研究表明，離子束誘變起因不僅是由于能量沉積引起的DNA單雙鏈斷裂，并且還通過離子注入過程中質、能、電多因子作用使遺傳物質分子、原子發生移位和重組，且其突變性狀具有多發性和重復性的特點，因此離子注入相當于一種復合誘變，比單一誘變更有效；此外在誘變過程中可以通過不同參數組合(離子種類、能量、注量、電荷數等)注入達到有益突變的調控最終獲得符合選育目標的突變菌株。但目前尚未發現應用離子注入技術改變生物溫度耐受性的報道。
[0007]
【發明內容】
[0008]解決的技術問題:本發明的目是提供一株耐高溫釀酒酵母及其在木質纖維素類原料同步糖化發酵燃料乙醇中的應用。
[0009]技術方案:耐高溫釀酒酵母cererisiae) NT102002,該菌株已在國家知識產權局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2014年7月3日，保藏單位名稱:中國典型培養物保藏中心，保藏地址:中國武漢武漢大學，保藏編號=CCTCC N0:M2014312o
[0010]所述耐高溫釀酒酵母cerevisiae') NT102002在木質纖維素類原料同步糖化發酵燃料乙醇中的應用。
[0011]所述發酵用培養基為PDA培養基。
[0012]所述發酵條件ρΗ5.5-6.0、發酵溫度范圍35_40°C及搖床轉速150r/min。
[0013]一種用于木質纖維素類原料同步糖化發酵燃料乙醇的組合物，有效成分為耐高溫釀酒酵母(SaccAaro焊Ce1S cerevisiae^) NT102002。
[0014]有益效果:本發明應用離子注入結合高溫馴化技術誘變篩選得到的耐高溫釀酒酵^iSaccharomyces cerevisiae) NT102002耐高溫40°C,可用于木質纖維素原料同步糖化發酵制備燃料乙醇，為提高釀酒酵母的溫度耐受性提供了新的可行的技術選擇；此技術相對于傳統的誘變育種技術方法簡單，突變率高，所得到的突變株性狀穩定。
[0015]
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1為釀酒酵母存活率曲線圖；
圖2為釀酒酵母突變率圖；
圖3為35°C NT102001發酵曲線圖；
圖4為40°C NT102002發酵曲線圖；
圖5為以麩皮和秸桿粉為原料發酵曲線圖；
圖6為乙醇標準曲線圖。
[0017]
【具體實施方式】
[0018]以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改和替換，均屬于本發明的范圍。
[0019]若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0020]實施例1耐高溫釀酒酵母誘變條件的確定
本發明所使用的釀酒酵母來源于安琪酵母股份有限公司。
[0021]挑取釀酒酵母單菌落涂布于PDA斜面培養基，在最適溫度30°C條件下培養至3-4天；挑取一環釀酒酵母接入PDA液體培養基中，30°C，120轉/分鐘的條件下培養24小時。
[0022]取0.1mL培養液均勻涂布于無菌空培養皿上，以無菌風吹至干燥后進行N+注入。所采用的離子注入機為LZD900型多功能離子注入機，靶室真空度為10_3Pa，以5s脈沖式注入，間隔 15s，注入能量為 1keV,注量分別為 50X 114 N+/cm2U00X 114 NVcm2U50X 114N+/cm2,200 X 114 N+/cm2、250 X 114 N+/cm2 和 300 X 1014N+/cm2。N+注入后，取出平皿，用 0.5mL無菌水洗脫，涂布到PDA固體培養基上，置于初篩溫度為33°C的培養箱中培養至長出單菌落，計數單菌落數目。根據單菌落數目統計菌株存活率，存活率曲線見圖1，然后繼續培養至成熟以備篩選。
[0023]挑取生長成熟的單菌落接于PDA斜面培養基，置于復篩溫度為32°C的培養箱中繼續培養，計數各注量下能夠繼續生長繁殖的菌株數量，計算各個注量的突變率，以正突變率最高的注量為最佳注量。本實施例中在注入能量為1keV的條件下，最佳離子注量為200X 114 N+/cm2，正突變率達到30% (見圖2)。以下實施例均以該注量進行注入誘變。
[0024]誘變篩選耐35°C的釀酒酵母
本發明所使用的釀酒酵母來源于安琪酵母股份有限公司。
[0025]挑取釀酒酵母單菌落涂布于PDA斜面培養基，在最適溫度30°C條件下培養至3-4天；挑取一環釀酒酵母接入PDA液體培養基中，30°C，120轉/分鐘的條件下培養24小時。
[0026]取0.1mL培養液均勻涂布于無菌空培養皿上，以無菌風吹至干燥后進行N+注入。N+注入后，取出平皿，用0.5mL無菌水洗脫，涂布到PDA固體培養基上，置于溫度為33°C的培養箱中培養至長出單菌落，挑取生長成熟的單菌落接于PDA斜面培養基，置于溫度為35°C的培養箱中繼續培養。在此條件下能夠生長的菌株即為耐35°C的釀酒酵母，命名為釀酒酵母 QSaccharomyces cerevisiae、NT102001。
[0027]取20g粗制纖維素、600U/g纖維素酶和1mL釀酒酵^iSaccharomycescerevisiae) miQ2QQl培養液裝入250 mL搖瓶中，以0.05 mo I/L的檸檬酸鈉緩沖液調節發酵液的起始pH值至5.5-6.0，加入蒸餾水定容到10mL,以150r/min于35°C條件下發酵，發酵結束后分析上清液中乙醇的質量濃度。應用釀酒酵母cerevisiae)NT102001發酵乙醇產量較釀酒酵母提高了 24.03%，發酵曲線見圖3。
[0028]誘變篩選耐40 V的釀酒酵母
本實施例所使用的釀酒酵母為釀酒酵母cerevisiae) NT102001。
[0029]挑取釀酒酵母cerevisiae、NT102001單菌落涂布于PDA斜面培養基，在35 °C條件下培養至3-4天；挑取一環釀酒酵母接入PDA液體培養基中，35°C，120轉/分鐘的條件下培養24小時。
[0030]取0.1mL培養液均勻涂布于無菌空培養皿上，以無菌風吹至干燥后進行N+注入。N+注入后，取出平皿，用0.5mL無菌水洗脫，涂布到PDA固體培養基上，置于溫度為35°C的培養箱中培養至長出單菌落，挑取生長成熟的單菌落接于PDA斜面培養基，置于溫度為40°C的培養箱中繼續培養，在此條件下能夠生長的菌株即為耐40°C高溫的釀酒酵母。命名為耐高溫釀酒酵母 iSscchaxomycGS cerevisiae) NT102002。
[0031]將20g粗制纖維素，600U/g纖維素酶和1mL釀酒酵^iSaccharomycescerevisiae) miQ2QQl培養液裝入250 mL搖瓶中，以0.05 mo I/L的檸檬酸鈉緩沖液調節發酵液的起始pH值至5.5-6.0，加入蒸餾水定容到10mL,以150r/min于35°C條件下發酵，發酵結束后分析上清液中乙醇的質量濃度。應用釀酒酵母cerevisiae)NT102001釀酒酵母發酵乙醇產量較釀酒酵母提高了 30.4%，發酵曲線見圖4。
[0032]將15g麩皮、5g稻桿粉、600U/g纖維素酶和1mL耐高溫釀酒酵母iSaccharomycescerevisiae) m\Q2m2培養液裝入250 mL搖瓶中，以0.05 mo I/L的檸檬酸鈉緩沖液調節發酵液的起始pH值至5.5-6.0,加入蒸懼水定容到10mL,以150r/min于35°C條件下發酵，發酵結束后分析上清液中乙醇的質量濃度。應用耐高溫釀酒酵母cerevisiae) m\Q2QQ2發酵乙醇產量較釀酒酵母提高了 38.4%，發酵曲線見圖5。
[0033]菌株的培養方法
所得到的耐高溫釀酒酵母cerevisiae^ NT102002適于用PDA固體培養基培養及保存。改菌株最高可耐受42°C的生長溫度，可耐受40°C發酵溫度；較原始出發菌株的最聞生長溫度提聞8°C，最聞發酵溫度提聞6°C ;同時保留穩定的發酵廣乙醇特性。
[0034]發酵產物的提取和分析
乙醇濃度檢測:準確稱取無水乙醇25.00 g,置于I L的容量瓶中，用超純水溶解并定容配成25 g/L的標準儲備液，實驗時用超純水稀釋至20g/L，15g/L，10g/L，5g/L。以各濃度乙醇標準溶液的吸收峰面積為縱坐標，乙醇濃度為橫坐標繪制標準曲線。標準曲線如圖6所示。用標準曲線計算發酵樣品乙醇濃度。色譜分析條件為:AT毛細管色譜柱(0.53mmX 18m)，柱溫70°C，柱流速6.36mL/min。FID檢測器，注射室溫度180°C，檢測器溫度120°C，進樣量1.0 μ L，載氣為氮氣。
【權利要求】
1.耐高溫釀酒酵母iSaccharomycescerevisiae)K[\Q2QQ2,該菌株已在國家知識產權局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2014年7月3日，保藏單位名稱:中國典型培養物保藏中心，保藏編號=CCTCC N0:M2014312o
2.權利要求1所述耐高溫釀酒酵母(在木質纖維素類原料同步糖化發酵燃料乙醇中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于所述發酵用培養基為PDA培養基。
4.根據權利要求2所述的應用，其特征在于所述發酵條件pH5.5-6.0、發酵溫度范圍35-40°C 及搖床轉速 150r/min。
5.一種用于木質纖維素類原料同步糖化發酵燃料乙醇的組合物，其特征在于有效成分為耐高溫釀酒酵母cerevisiae、NT102002。
【文檔編號】C12P19/14GK104371938SQ201410654463
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月17日 優先權日:2014年11月17日
【發明者】張寧, 蔣劍春, 衛民, 楊靜, 趙劍 申請人:中國林業科學研究院林產化學工業研究所