專利名稱：一種刺參致病菌的分離和鑒定方法
技術領域：
本發明涉及一種刺參致病菌分離和鑒定的方法，屬微生物技術領域。
背景技術：
由于刺參養殖的過速發展和不規范運作造成了病害問題日趨突出，出現了多種明顯病癥和大規模死亡現象，其中，越冬保苗期和養成期出現的“腐皮綜合征”是目前刺參養殖中危害最為嚴重的疾病。給廣大刺參養殖業者造成了慘重的經濟損失，也嚴重制約了該產業的持續穩定發展。為保證刺參養殖業健康發展，積極開展“腐皮綜合征”流行病學及病原學研究是對疾病進行綜合防治必不可少的基礎性工作。“腐皮綜合征”是當前刺參養殖中最常見、危害最為嚴重的疾病，該病發生率可達 80%，遍及各養殖區域；傳染性強，許多養殖單位的死亡率高達90%以上。越冬保苗期幼參和養成期海參均可被感染發病，每年的12 3月份養殖水體溫度較低時(8°C以下)為發病高峰，在溫度較高的夏秋季節也有發生。主要癥狀從初期感染的口部腫脹、吐腸、收縮僵直， 到后期感染的體表大面積潰瘍，最后導致刺參死亡。病原排查發現該病主要是由細菌引起的。
發明內容
本發明提供了一種刺參致病菌的分離和鑒定方法，分離鑒定細菌快速、準確、污染率低、純度高、菌株變異極小，保持了病原菌野生型的特性。過程簡單、成本低，可大量獲得刺參致病菌，以滿足刺參疾病的早期診斷、預防和治療。本發明的技術方案如下A、標樣選擇選取刺參腐皮組織，在發病處切取IcmX IcmX Icm組織樣品；B、組織樣品消毒將組織樣品經用75%酒精消毒60-90秒后，用滅菌海水沖洗，再用無菌PBS沖洗2-4次，組織勻漿，劃線于固體瓊脂培養基；C、細菌的獲得將培養皿上長出的菌落再次采用平板劃線分離法進行分離， M-28°C培養箱中培養48-7 后觀察，根據菌落形態、顏色細菌培養性狀，挑選單菌落，然后將細菌純培養保存；D、刺參腐皮綜合癥致病菌的篩選將獲得的純培養細菌接種到TCBS選擇性培養基上，24- °C培養箱中培養48-7 后觀察，篩選半透明、淡黃色的單個菌落；E、刺參回接感染動物實驗驗證篩選菌落的致病性，分別通過浸泡和體腔注射實驗來觀察細菌致病性；F、掃描電鏡觀察致病菌的形態結構；G、通過16s rDNA PCR分子生物學方法對致病性單菌落進行鑒定。
圖1是患病刺參圖。
圖2是TCBS培養皿上的單菌落圖。圖3是單個細菌掃描電鏡圖。圖4是病原菌分子生物學鑒定的系統進化樹圖。
具體實施例方式實施例1、病灶處優勢菌的分離純化取患有腐皮綜合癥的刺參樣品(見圖1)于超凈工作臺中切取IcmX IcmX Icm大小的組織塊，放于5mL無菌離心管中，用消毒過的眼科剪刀勻漿制成菌懸液。劃線于固體瓊脂培養基，M_28°C培養箱中培養48-72后，將培養皿上長出的菌落再次采用特異性TCBS平板劃線分離法進行分離，2448°C培養箱中培養48-72后觀察，根據菌落形態、顏色細菌培養性狀，挑選單菌落，然后將細菌純培養保存。結果菌落呈煎蛋形狀，扁平，直徑約為3 5mm，表面凸起，為玉米黃色，不透明， 無氣味，不易挑起菌體，菌落光滑且有粘性。(見圖1)實施例2、菌種保藏將上述方法制得的純病原菌培養于平板上的單菌落直接接種于2216E固體斜面上，放置于培養箱中下培養Mh，然后于4°C的冰箱中保存；長期保藏將菌體放入2216E液體培養基中培養，培養約5 6個小時，菌體濃度達到對數期生長期0D_ = 0. 2時，加入甘油，將甘油體積濃度調整為30 50%左右，-80°C 冰箱保存即可。實施例3、致病菌的人工回接感染實驗(1)實驗前的準備將容積約SOOOmL的塑料盆用洗滌劑清洗后用75%酒精擦拭消毒，待酒精揮發后用過濾滅菌PBS沖洗三遍。向每只盆中分別注入5000mL海水，并用充氣閥通氣，海水溫度維持在18 25°C。(2)刺參的前處理將從養殖場取回的刺參先在實驗室環境中用過濾滅菌海水馴養7天，挑選大小相近，健康的個體，用滅菌PBS沖洗2次，每個盆中投放10頭。(3)菌懸液的制備將分離到優勢菌株劃平板，下培養48h，用過濾滅菌PBS將菌落沖洗下制成菌懸液約20mL。取ImL菌懸液，梯度稀釋后用分光光度計計數。(4)人工回接感染實驗①浸浴法實驗設4組，每組投入50頭養殖刺參。實驗組采用浸浴法攻毒，向編號不同的盆中分別注入不同體積的菌懸液，使其終濃度分別為IO4CFU HilAlO3CFUmlAlO2CFU πι Λ對照組中加入與最大注入量相同體積的制備菌懸液所用的過濾滅菌PBS。每天觀察各盆中刺參的發病及死亡狀況，第7天實驗結束，整個實驗過程中，注意觀察刺參形態變化并拍照記錄。②腹腔注射法實驗設6組，每組投入10頭養殖刺參。實驗組菌懸液用Iml無菌注射器經腹腔注射對刺參進行感染，每頭注射量在0. 5ml，使其菌懸液濃度依次為103、104、105、106、107CFU ml—1，對照組注射等量的無菌PBS。注射感染開始后，每天做好記錄，第7天實驗結束，整個實驗過程中，注意觀察刺參形態變化并拍照記錄。
結果表1浸浴法回接感染實驗結果
權利要求
1. 一種刺參致病菌的分離和鑒定方法，其特征在于如下步驟A、標樣選擇選取刺參腐皮組織，在發病處切取IcmXIcmX Icm組織樣品；B、組織樣品消毒將組織樣品經用75%酒精消毒60-90秒后，用滅菌海水沖洗，再用無菌PBS沖洗2-4次，組織勻漿，劃線于固體瓊脂培養基；C、細菌的獲得將培養皿上長出的菌落再次采用平板劃線分離法進行分離，2418°C培養箱中培養48-7 后，挑選單菌落，然后將細菌純培養保存；D、刺參腐皮綜合癥致病菌的篩選將獲得的純培養細菌接種到TCBS選擇性培養基上， 24-28 °C培養48-7 后，篩選半透明、淡黃色的單個菌落；E、刺參回接感染動物實驗驗證篩選菌落的致病性，分別通過浸泡和體腔注射實驗來觀察細菌致病性；F、掃描電鏡觀察致病菌的形態結構；G、通過16srDNA PCR分子生物學方法對致病性單菌落進行鑒定。
全文摘要
本發明公開了一種刺參致病菌的分離和鑒定方法，其特征在于將含有目標病致病菌的刺參組織，經用75％酒精消毒60-90秒后，用無菌海水沖洗，將病灶組織勻漿，滴加無菌PBS緩沖液，用接種環沾取含菌液劃線于適于刺參腐皮綜合癥病原菌生長的瓊脂培養基上，24-28℃培養，再通過特異性TCBS培養基純化篩選單個菌落，即可得到相應的目標細菌，通過刺參回接感染動物實驗來驗證分離得到細菌的致病性以及掃描電鏡觀察細菌的形態結構，進一步采用16srDNA PCR技術來鑒定分離的致病菌。本發明具有操作簡便、方法易行、能快速有效的篩選出刺參腐皮綜合癥的病原菌，同時為其他水產動物病害致病菌的快速篩選提供了思路。
文檔編號C12Q1/04GK102296038SQ20111023034
公開日2011年12月28日 申請日期2011年8月11日 優先權日2011年8月11日
發明者徐永平, 李曉宇, 譚德猛, 金禮吉 申請人:大連理工大學