植物過氧化物酶在絲狀真菌中的表達的制作方法

植物過氧化物酶在絲狀真菌中的表達的制作方法
【專利摘要】本發明涉及植物來源的過氧化物酶在絲狀真菌宿主生物體中的重組表達。
【專利說明】植物過氧化物酶在絲狀真菌中的表達
[0001]對序列表的引用
[0002]本申請包含計算機可讀形式的序列表，其并入本文以作參考。
【技術領域】
[0003]本發明涉及用于野生型植物過氧化物酶、或從中衍生的過氧化物酶在絲狀真菌宿主生物體中的重組表達的方法和組合物。
【背景技術】
[0004]過氧化物酶和漆酶是已知的屬于氧化還原酶的酶。過氧化物酶屬于ECl.11.1.7酶類，漆酶則屬于ECl.10.3.2。兩種酶類均能夠氧化底物，因而它們經常用于漂白應用中。商業應用包括斜紋粗棉布的漂白(牛仔褲上的磨損樣式)、織物染色工序之后的漂洗水的漂白、以及洗滌工序過程中的染料轉移抑制。
[0005]通常從植物中純化植物過氧化物酶，但這是產率較低的復雜工序。或者，可以使用在細菌或酵母中的重組表達，但其收率也較低。因此，對于過氧化物酶和漆酶的高效重組生產的需求是較為明顯的。
[0006]然而，科技文獻中沒有呈現植物來源的氧化還原酶在絲狀真菌例如曲霉(Aspergillus)中表達的例子。曲霉菌和其他絲狀真菌經常被用作酶的重組表達的高效表達宿主。因為研究者幾乎不在文獻中報道行不通的內容，由此據信，缺乏氧化還原酶表達的成功案例說明，在絲狀真菌中表達植物來源氧化還原酶被認為是不可能的(技術偏見)。
[0007]植物來源的氧化還原酶不能在例如曲霉中表達的假設由本發明
【發明者】早先未能成功地嘗試出在曲霉中表達多種植物來源漆酶的事實所支持。

【發明內容】

[0008]本發明的
【發明者】已經發現，實際上可以在曲霉宿主細胞中表達植物過氧化物酶。因此，本發明提供用于野生型植物過氧化物酶、或從其衍生的過氧化物酶的重組表達的方法，包括在絲狀真菌宿主生物體中表達編碼過氧化物酶的核酸序列，其中過氧化物酶的氨基酸序列包括選自以下的一種或更多種氨基酸基序:
[0009]HFHDCFV ；
[0010]GCD[A，G]S[V, I] [I，L] [I，L];和
[0011]VSC[A, S]D[I, L] [I, L] ?
【具體實施方式】
[0012]定義
`[0013]序列同一性:兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間的關聯性通過參數“序列同一'I"生”來描述。
[0014]出于本發明的目的，使用在EMBOSS軟件包(EMBOSS:TheEuropean MolecularBiology Open Software Suite (歐洲分子生物學開放軟件包),Rice 等人,2000, TrendsGenet.16:276-277)(優選 3.0.0 版本或更新)的 Needle 程序中執行的 Needleman-Wunsch算法(Needleman and Wunsch, 1970，J.Mol.Biol.48:443-453),來確定兩個氛基酸序列之間的序列同一性程度。使用的可選參數是，空位開放罰分為10，空位擴展罰分為0.5，以及EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本)替換矩陣。Needle標記的“最長同一性”的輸出(使用-nobrief選項得到的)被用作百分比同一性并如下計算:
[0015](相同殘基X100) / (比對長度-比對中的空位總數)。
[0016]出于本發明的目的，使用在EMBOSS軟件包(EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite (歐洲分子生物學開放軟件包)，Rice等人，2000,同上)(優選3.0.0版本或更新)的Needle程序中執行的Needleman-Wunsch算法(Needleman andWunsch, 1970，同上)，來確定兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的序列同一性程度。使用的可選參數是，空位開放罰分為10，空位擴展罰分為0.5，以及EDNAFULL (NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)替換矩陣。Needle標記的“最長同一性”的輸出(使用-nobrief選項得到的)被用作百分比同一性并如下計算:
[0017](相同脫氧核糖核苷酸X100)/(比對長度-比對中的空位總數)。
[0018]編碼序列:術語“編碼序列”是指多核苷酸，其直接明確多肽的氨基酸序列。編碼序列的邊界通常由開放閱讀框決定，其通常以ATG起始密碼子或可替代的起始密碼子如GTG和TTG開始，并以終止 密碼子例如TAA、TAG和TGA結束。編碼序列可以是DNA、cDNA、合成的或重組的多核苷酸。
[0019]cDNA:術語“cDNA”是指可以通過得自真核細胞的成熟的、剪切的mRNA分子進行反轉錄而制得的DNA分子。cDNA缺少可能存在于相應基因組DNA中的內含子序列。早先的初始RNA轉錄子是mRNA的前體，其在呈現為成熟的剪切的mRNA之前要經一系列的步驟加工，包括剪切。
[0020]核酸構建體:術語“核酸構建體”是指從天然存在的基因中分離的、或以自然中不會另外出現的方式被修飾成包含核酸片段的、或合成的單鏈或雙鏈的核酸分子。當核酸構建體含有表達本發明的編碼序列所需的控制序列時，術語核酸構建體與術語“表達盒”同義。
[0021]控制序列:術語“控制序列”是指對于編碼本發明多肽的多核苷酸的表達為必需的所有構件。各個控制序列對于編碼多肽的多核苷酸可以是原生的或外源的，或者相互為原生的或外源的。這樣的控制序列包括但不限于，前導序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉錄終止子。控制序列至少包括啟動子、以及轉錄和翻譯終止信號。出于引入特定限制性酶切位點的目的，控制序列可具有接頭，其促進控制序列與編碼多肽的多核苷酸的編碼區域的連接。
[0022]可操作地連接:術語“可操作地連接”是指如下的構造，其中，控制序列相對于多核苷酸的編碼序列安置在合適位置處，從而控制序列指導編碼序列的表達。
[0023]表達:術語“表達”包括涉及到多肽生產中的任何步驟，包括但不限于:轉錄、轉錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾以及分泌。
[0024]表達載體:術語“表達載體”是指包括編碼多肽的多核苷酸并且與用于其表達的其它核苷酸可操作地相連接的線性或環狀DNA分子。[0025]宿主細胞:術語“宿主細胞”或“宿主生物體”是指對轉化、轉染、轉導等敏感的任何細胞類型，其具有包含本發明的多核苷酸的核酸構建體或表達載體。術語“宿主細胞”包括因復制過程中發生的突變而與親本細胞不同的親本細胞的任意后代。
[0026]討氣化物酶
[0027]EC 號可以用于酶的分類。對 Recommendations of the Nomenclature Committeeof the International Union of Biochemistry and Molecular Biology, Academic PressInc.，1992做出參考。
[0028]應該理解的是，術語酶，以及本文提及的各種酶和酶類，包括野生型的酶、以及其保留所考慮活性的任何變體。可以通過重組技術而產生這些變體。野生型酶也可以通過重組技術、或通過從天然來源分離并純化而產生。
[0029]在特定實施方式中，所考慮的酶是明確的(well-defined)，表明僅存在一種主要的酶組分。這可以例如通過在合適的尺寸排阻層析柱上分級而進行推斷。這些明確的、或純化的、或高度純化的酶可以按領域中已知的和/或與所考慮的特定酶相關的公開物中的描述而得到。
[0030]根據本發明的過氧化物酶是包括在ECl.11.1.7酶類中的植物過氧化物酶、或從其衍生的表現出過氧化物酶活性的任何片段。植物過氧化物酶屬于III類過氧化物酶。
[0031]III類過氧化物酶或分泌的植物過氧化物酶(EC1.11.1.7)僅在植物中發現，其中它們形成較大的多基因家族。盡管它們的一級序列在某些點與I類和II類不同，但它們的三維結構與II類非常相似，并且它們也具有鈣離子、二硫鍵和N端信號以分泌。
[0032]III類過氧化物酶還能夠進行第二循環反應，稱為羥化，其與過氧化循環不同。在羥化循環過程中，過氧化物酶經Fe(II)狀態，并主要利用超氧陰離子(02_)來生成羥基(OH)0已知利用這兩種循環 的III類過氧化物酶會參與從萌芽到衰老的很多不同的植物過程，例如，生長素代謝、細胞壁伸長和硬化、或保護免受病原體(還參見Passardi等人.“Theclass III peroxidase multigenic family in rice and its evolution in land plants”，Phytochemistry, 65(13)，pp.1879-93(2004))?
[0033]過氧化物酶的氨基酸序列包括植物過氧化物酶的特征基序。優選地，過氧化物酶包括選自以下的一種、兩種或三種氨基酸基序:
[0034]HFHDCFV(SEQ ID NO:5);
[0035]GCD[A，G]S[V, I] [I，L] [I，L] (SEQ ID NO:69) -M
[0036]VSC[A, S]D[I, L] [I, L](SEQ ID N0:70)。
[0037]更優選地，過氧化物酶包括選自以下的一種、兩種或三種氨基酸基序:
[0038]HFHDCFV(SEQ ID NO:5);
[0039]GCD[A，G]S[V, I]LL(SEQ ID N0:6);和
[0040]VSC[A, S]D[I, L]L(SEQIDN0:7)。
[0041]更優選地，過氧化物酶包括選自以下的一種、兩種或三種氨基酸基序:
[0042]HFHDCFV(SEQ ID NO:5);
[0043]GCD[A，G]S[V, I]L(SEQ ID N0:68);和
[0044]VSC[A, S]D[I, L]L(SEQIDN0:7)。
[0045]本發明的過氧化物酶包括與SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:45的氨基酸38?354、SEQ ID NO:55的氨基酸30?362、或SEQ ID NO:67的氨基酸23?324的氨基酸序列具有至少60%同一性例如至少65%同一性、至少70%同一性、至少75%同一性、至少80%同一性、至少85%同一性、至少90%同一性、或至少95%同一性的氨基酸序列。
[0046]在一個實施方式中，過氧化物酶由與SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:45的氨基酸38?354、SEQ ID NO:55的氨基酸30?362、或SEQ ID NO:67的氨基酸23?324的氨基酸序列具有至少60%同一性例如至少65%同一性、至少70%同一性、至少75%同一性、至少80%同一性、至少85%同一性、至少90%同一性、或至少95%同一性的氨基酸序列構成。
[0047]在另一個實施方式中，過氧化物酶可以與SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ IDN0:45的氨基酸38?354、SEQ ID NO: 55的氨基酸30?362、或SEQ ID N0:67的氨基酸23?324的氨基酸序列相同，或與之相比具有一個或多個氨基酸差異；例如，與SEQ IDNO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 45 的氨基酸 38 ?354、SEQ ID NO: 55 的氨基酸 30 ?362、或SEQ ID NO:67的氨基酸23?324的氨基酸序列相比，最多具有10個氨基酸差異；或最多9、8、7、6、5、4、3、2或I個氨基酸差異。
[0048]優選地，本發明的過氧化物酶是大豆過氧化物酶(例如，SEQ IDN0:2)或從大豆過氧化物酶衍生的；或皇家棕櫚樹過氧化物酶(例如，SEQ ID NO: 4 )或從皇家棕櫚樹過氧化物酶衍生的；或楊樹過氧化物酶(例如，SEQ ID NO: 45的氨基酸38?354)或從楊樹過氧化物酶衍生的；或玉米過氧化物酶(例如，SEQ ID NO: 55的氨基酸30?362)或從玉米過氧化物酶衍生的；或煙草過氧化物酶(例如，SEQ ID NO: 67的氨基酸23?324)或從煙草過氧化物酶衍生的。
[0049]過氧化物酶活性(POXU)的確定
[0050]一個過氧化物酶單位(POXU)是在含有0.1M磷酸鹽緩沖液(pH7.0),0.88mM過氧化氫和1.67mM2，2’-連氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉_6_磺酸鹽)(ABTS)的水溶液中，在30°C下每分鐘催化I μ mol過氧化氫轉化的酶量。
[0051]反應持續60秒(混合后15秒)并測量418nm處的吸光度變化。吸光度應該在
0.15?0.30的范圍內。使用氧化ABTS的吸收系數以及每氧化2 μ mol ABTS轉化I μ mol H2O2的化學計量,來計算過氧化物酶活性。
[0052]本發明的方法和用途
[0053]通常而言，從植物純化植物過氧化物酶，但這是收率較低的復雜工序。或者，可以使用在細菌或酵母中的重組表達，但是經常造成很低的收率和/或較難的純化。因此，對于植物來源過氧化物酶的高效重組生產的需求是明顯的。
[0054]根據本發明，野生型植物過氧化物酶和從其衍生的過氧化物酶可以在絲狀真菌宿主細胞中作為重組蛋白進行生產，其經常解決收率低和/或純化困難的問題。
[0055]蛋白的重組表達不常是直截了當的，并且難以預測實際上是否能在特定的生產宿主生物體中產生所需的產物以及產物收率是否會足以建立經濟的生產。
[0056]多個參數會導致絲狀真菌宿主中表達的缺失。通常而言，分泌的并正確加工的過氧化物酶在絲狀真菌中的表達涉及多個步驟，其中任何步驟可能是限制性的步驟。
[0057]首先，插入的過氧化物酶基因被轉錄成hnRNA。然后hnRNA從核被轉送到胞漿，并且在此過程中成熟為mRNA。通常，mRNA池建立在胞衆中，以維持翻譯。之后，mRNA被翻譯成蛋白前體，接著該前體在翻譯時或在翻譯后分泌到內質網(ER)。在易位進入ER中時，分泌信號肽被信號肽酶切割，所得的蛋白在ER中折疊。當適當的折疊被細胞識別后，蛋白隨后被分泌到高爾基體。此處，前肽將被切割，以釋出成熟的過氧化物酶。因此，存在多種可能性妨礙基因序列在給定的宿主生物體中充分表達。
[0058]為了使編碼所需蛋白的多核苷酸序列高效表達，翻譯過程必須是高效的。因此，本發明的一個目的是使編碼過氧化物酶蛋白的mRNA序列優化，以獲得在絲狀真菌宿主細胞中的充分表達。
[0059]在一個實施方式中，本發明涉及用于在絲狀真菌宿主生物體中重組表達野生型植物過氧化物酶的方法,包括在絲狀真菌宿主生物體中表達編碼野生型植物過氧化物酶的修飾核酸序列，其中，修飾的核酸序列與編碼野生型植物過氧化物酶的野生型核酸序列至少在一個密碼子上有區別。
[0060]可以通過a)提供編碼野生型植物過氧化物酶的野生型核酸序列，以及b)修飾該核酸序列的至少一個密碼子來獲得修飾的核酸序列，從而使修飾的核酸序列與編碼野生型植物過氧化物酶的各個野生型核酸序列在至少一個密碼子上有區別。修飾核酸序列的方法為本領域技術人員所熟知。在特定實施方式中，修飾不改變由該密碼子編碼的氨基酸的特性(identity)。
[0061]因此，在另一個方面，本發明的目的通過在絲狀真菌宿主生物體中重組表達野生型植物過氧化物酶的方法而實現，其包括以下步驟:
[0062]i )提供編碼野生型植物過氧化物酶的核酸序列，該核酸序列包括至少一個修飾的密碼子，其中修飾不改變由該密碼子編碼的氨基酸，且該密碼子的核酸序列與編碼野生型基因的核酸序列中的對應密碼子不同；
[0063]ii)在絲狀真菌宿主中表達修飾的核酸序列。
[0064]根據本實施方式，待修飾的起始核酸序列是編碼感興趣的植物過氧化物酶的野生型核酸序列。
[0065]根據本發明的修飾，包括對堿基三聯體的任何修飾，在特定實施方式中，它們包括不改變該密碼子所編碼的氨基酸的特性的任何修飾，即由原始密碼子所編碼的氨基酸與修飾密碼子所編碼的氨基酸是相同的。在大多數情況中，修飾會是在第三個位置，然而，在一些情況中，修飾也可以是在第一或第二位。如何修飾密碼子同時不改變所得的氨基酸是技術人員已知的。
[0066]對于以上兩個實施方式，為了獲得充分表達所需的應當不同的密碼子的數量或修飾的數量可以改變。因此，根據本發明的又一實施方式，修飾的核酸序列與編碼野生型植物過氧化物酶的各個野生型核酸序列在至少2個密碼子上不同或至少2個密碼子被修飾，特別是至少3個密碼子，更特別地為至少5個密碼子，更特別地為至少10個密碼子，更特別地為至少15個密碼子，甚至更特別地為至少25個密碼子。
[0067]還發現，通過將野生型核酸序列的密碼子使用改變為在優選被用作宿主的絲狀真菌所利用的密碼子中選擇，本發明的過氧化物酶表達在如今是可行的。這些密碼子被稱為對于表達是“優化的”。
[0068]由于遺傳密碼的簡并性和在特定生物體/細胞中對某些優選密碼子的偏好，在某些實例中可以通過優化密碼子使用來改善蛋白在指定宿主細胞中的表達水平。在當前的情形中，當編碼 SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:45 的氨基酸 38 ?354、SEQ ID NO:55的氨基酸30?362和SEQ ID NO:67的氨基酸23?324的野生型核酸序列通過密碼子優化被優化并在曲霉中表達時，植物過氧化物酶的收率是極佳的。
[0069]在本發明中，“密碼子優化”是指由于遺傳密碼的簡并性，多于一個的三聯體密碼子可以用于各個氨基酸。一些密碼子在特定生物體中將是優選的，并且，通過將野生型基因中的密碼子使用改變成在特定表達宿主生物體中優選的密碼子使用，密碼子被認為是優化的。密碼子優化可以例如按照在Gustafsson等人.，2004，(Trends in Biotechnologyvol.22 (7) ; Codon bias and heterologous protein expression)和 US6, 818，752 中所述的來進行。
[0070]密碼子優化可以是基于宿主生物體的平均密碼子使用，或者其可以基于已知在特定宿主細胞中大量表達的特定基因的密碼子使用。
[0071]在本發明的一個實施方式中，過氧化物酶蛋白由在至少10%密碼子上優化的修飾核酸序列密碼子所編碼，更特別地為至少20%，或至少30%，或至少40%，或特別地為至少50%,更特別地為至少60%，更特別地為至少75%。因此，修飾的核酸序列可以與編碼野生型過氧化物酶的各個野生型核酸序列在至少10%密碼子上有區別，更特定地為至少20%，或至少30%，或至少40%，或特別地為至少50%，更特別地為至少60%，更特別地為至少75%。具體而言，密碼子可以不同，因為它們·與編碼野生型植物過氧化物酶的野生型核酸序列相比，已進行密碼子優化。
[0072]特別地，100%的核酸序列已進行密碼子優化，以與絲狀真菌中使用的優選密碼子相配。
[0073]在特定實施方式中，密碼子優化是基于米曲霉(Aspergillus oryzae)的α -淀粉酶的密碼子使用，該α-淀粉酶也稱為FungamylTM(W02005/019443;SEQ ID Ν0:2)，其是已知在絲狀真菌中高水平表達的蛋白。在當前的上下文中，對應于構成感興趣蛋白的分泌蛋白的總量的至少20%、優選至少30%、更優選至少40%、甚至更優選至少50%的表達水平被認為是聞水平的表達。
[0074]在特定實施方式中，編碼成熟的植物過氧化物酶的修飾核酸序列選自SEQ IDNO: 1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:44 的氨基酸 118 ?1068、SEQ ID NO:54 的氨基酸 94 ?1092、或 SEQ ID NO:66 的氨基酸 67 ?972。
[0075]在實際中，根據本發明的優化包括以下步驟:
[0076]i)如以下更詳細闡釋的，對編碼本發明過氧化物酶的核酸序列進行密碼子優化；
[0077]ii)檢查所得的修飾序列的平衡GC含量(約45?55%);和
[0078]iii)如以下闡釋的，檢查或編輯從步驟ii)得到的修飾序列。
[0079]密碼子優化的操作指南(protocol):
[0080]單個基因、多個基因或整個基因組的密碼子使用可以使用EMBOSS包的cusp程序進行計算(http://www.rfcgr.mrc.ac.uk/Software/EMB0SS/)o
[0081]優化的起始點是蛋白的氨基酸序列或編碼蛋白的核酸序列連同密碼子表。通過密碼子優化的基因，以及密碼子表給出的密碼子統計信息，我們可知曉編碼給定蛋白序列的核酸序列。
[0082]提及的密碼子統計信息是cusp程序的輸出中被稱為“Fract”的密碼子表中的列，其描述指定密碼子在其他同義密碼子中的分數。我們把這個稱為局部得分(local score)。如果例如編碼F的80%密碼子是TTC而編碼F的20%密碼子是TTT，則密碼子TTC具有0.8的局部得分，TTT具有0.2的局部得分。
[0083]密碼子表中的密碼子首先是按編碼氨基酸進行重排序(例如，按字母順序)然后按得分來升序排序。在以上的例子中，將F的密碼子排序為TTT、TTC。之后通過順序添加得分來生成密碼子的累積得分。在以上的例子中，TTT具有0.2的累積得分，且TTC具有I的累積得分。最常用的密碼子通常會具有I的累積得分。
[0084]為產生密碼子優化的基因，進行如下步驟。對于氨基酸序列中的各個位置，生成O與I之間的隨機數字。這是通過在程序運行的計算機系統中的隨機數字生成器而完成的。第一個累積得分比所生成的隨機數字更大或相等的密碼子被選為密碼子。在以上例子中，如果基因中的特定位置是“F”且隨機數字生成器給出0.5，則TTC被選為密碼子。
[0085]避免內含子的對策是確保沒有分支點。這是通過確保序列中不存在米曲霉中分支點的共有序列CT [AG] A [CT]來完成的。序列[AG] CT [AG] A [AG]可被識別為內含子中的分支點。因此，在本發明的特定實施方式中，根據本發明的方法，這樣的序列也可以被修飾或除去。這在后加工步驟中完成，其中對序列掃描該基序的存在，通過將基序中的密碼子改變成同義密碼子來剔除各個事件，先選擇最佳局部得分的密碼子。
[0086]示出米曲霉α -淀粉酶的密碼子使用的密碼子表在以下給出。
[0087]表1.米曲霉α-淀粉酶的密碼子使用
[0088](⑶SP密碼子使用文檔)
[0089]
密Wi.刼坫酸 Fract /1000 數
GCA A0.286 24.000 12
GCC A0.357 30.000 15
GCG A0.238 20.000 10
GCT A0.119 10.000 5
TGC C0.222 4,000 2
TGT C0.778 14.000 7
GAC D0.524 44.000 22
GAi' D0.476 40.000 20`
GAA E0.417 10.000 5
[0090]
【權利要求】
1.一種用于植物過氧化物酶的重組表達的方法，包括在絲狀真菌宿主生物體中表達編碼過氧化物酶的核酸序列，其中所述過氧化物酶的氨基酸序列包括選自以下的一種、兩種或三種氨基酸基序:
HFHDCFV ；
GCD [A, G]S[V, I] [I，L] [I，L];和
VSC[A, S]D[I, L] [I, L]。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述基序選自:
HFHDCFV ；
GCD [A, G] S [V, I] LL -M·
VSC[A, S]D[I, L]L。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述過氧化物酶是ECl.11.1.7的III類過氧化物酶。
4.根據權利要求1?3中任一項所述的方法，其中所述過氧化物酶的氨基酸序列與SEQID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:45 的氨基酸 38 ?354、SEQ ID NO:55 的氨基酸 30 ?362、或SEQ ID NO: 67的氨基酸23?324的氨基酸序列具有至少65%同一性，優選至少70%同一性、至少75%同一性、至少80%同一性、至少85%同一性、至少90%同一性、或至少95%同一I"生。
5.根據權利要求1?4中任一項所述的方法，其中所述過氧化物酶由SEQID NO:2、SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:45 的氨基酸 38 ?354、SEQ ID NO:55 的氨基酸 30 ?362、或 SEQID NO:67的氨基酸23?324的氨基酸序列構成。
6.根據權利要求1?5中任一項所述的方法，其中所述核酸序列與用于表達所述過氧化物酶的合適的控制序列相連。
7.根據權利要求1?6中任一項所述的方法，其中所述核酸序列的至少一個密碼子被優化，以在絲狀真菌宿主生物體中翻譯。
8.根據權利要求1?6中任一項所述的方法，其中所述核酸序列的至少一半密碼子被優化，以在絲狀真菌宿主生物體中翻譯。
9.根據權利要求1?6中任一項所述的方法，其中所述核酸序列有至少10%的密碼子，優選至少20%的密碼子，更優選至少30%的密碼子，更優選至少50%的密碼子，最優選至少75%的密碼子被密碼子優化。
10.根據權利要求7?9中任一項所述的方法，其中所述優化的密碼子與米曲霉α淀粉酶的密碼子使用相對應。
11.根據權利要求1?10中任一項所述的方法，其中所述絲狀真菌宿主生物體選自支頂孢屬、曲霉屬、鐮孢霉屬、腐質霉屬、毛霉屬、毀絲霉屬、脈孢菌屬、青霉屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬或木霉屬。
12.根據權利要求1?10中任一項所述的方法，其中所述絲狀真菌宿主生物體是曲霉菌，優選為泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、黑曲霉、構巢曲霉或米曲霉。
13.根據權利要求1?10中任一項所述的方法，其中所述絲狀真菌宿主生物體是米曲霉或黑曲霉。
14.一種編碼野生型過氧化物酶并能在絲狀真菌宿主生物體中表達的修飾的核酸序列，其中所述修飾的核酸序列與編碼所述野生型過氧化物酶的野生型核酸序列在至少一個密碼子上不同，且其中所述過氧化物酶與大豆過氧化物酶或皇家棕櫚樹過氧化物酶具有至少60%同一'丨生并且包括選自以下的一種、兩種或三種氨基酸基序:
HFHDCFV ；
GCD [A, G] S [V, I] LL -M
VSC[A, S]D[I, L]L。
15.根據權利要求14所述的修飾的核酸序列，其中至少一個密碼子的修飾被優化，以在曲霉宿主生物體中翻譯。
16.根據權利要求15所述的修飾的核酸序列，其中所述曲霉宿主生物體是泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、黑曲霉、構巢曲霉或米曲霉。
17.根據權利要求16所述的修飾的核酸序列，其中所述曲霉宿主生物體是米曲霉或黑曲霉。
18.根據權利要求14?17中任一項所述的修飾的核酸序列，其中所述密碼子使用與米曲霉α淀粉酶的密碼子使用相對應。
19.根據權利要求14?18中任一項所述的修飾的核酸序列，其見SEQID ΝΟ:1、3、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64 或66。
20.一種編碼過氧化物酶并能在絲狀真菌宿主生物體中表達的修飾的核酸序列，其與選自 SEQ ID N0:l、3、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64和66的核 酸序列具有至少50%同一性，優選至少60%同一性、至少70%同一性、至少80%同一性或至少90%同一性。
21.—種重組的絲狀真菌宿主生物體，包括權利要求14?20中任一項所述的修飾的核酸序列。
22.根據權利要求21所述的重組的絲狀真菌宿主生物體，其為曲霉菌。
23.根據權利要求21所述的重組的絲狀真菌宿主生物體，其為泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、黑曲霉、構巢曲霉或米曲霉。
24.根據權利要求21所述的重組的絲狀真菌宿主生物體，其為米曲霉或黑曲霉。
【文檔編號】C12N9/08GK103443268SQ201280005474
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2012年1月20日 優先權日:2011年1月20日
【發明者】L·H·厄斯特高, L·卡盧姆 申請人:諾維信公司