專利名稱：一種草烏甲素多泡脂質體及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種草烏甲素的緩釋制劑，特別涉及一種草烏甲素多泡脂質體及其制備方法。
背景技術：
草烏甲素(Bulleyaconitine A)是從我國云南烏頭屬植物滇西嘟拉(Aconitum bulleyanum Diels)中分離得到的一種具有顯著鎮痛作用的生物堿(即滇西嘟拉堿)，其相對鎮痛作用為嗎啡的15倍，阿司匹林的1208倍，且連續用藥不產生鎮痛作用耐受，是一種不同于嗎啡類的非成癮性鎮痛劑。該藥現有片劑、口服液、膠囊和注射劑。其中片劑、口服液已為現行版中國藥典收載。由于草烏甲素半衰期較短，因此現有制劑臨床使用均需多次給藥，患者依從性差，且鎮痛作用短而影響療效，開發其緩釋制劑是臨床所需。
另一方面，Kim等人于1983年最先發現并研究了多泡(多囊)脂質體，他們通過復乳法，以磷脂、膽固醇和中性脂質為成膜材料，以氯仿和乙醚為有機溶劑，成功制備了多泡脂質體，并憑借光學顯微鏡和電鏡觀察了多泡脂質體的微觀結構。在制備過程中，首先將藥物溶液和油相在機械作用力下形成油包水(W/O)型初乳，再將初乳與外水相混合制得復乳，通過氮氣吹干除去有機溶劑制得多泡脂質體混懸液。多泡脂質體顆粒的平均粒徑在5～50μm之間。通過復乳法制備得多泡脂質體具有高包封率(20％～90％)、高載藥量、高穩定性(4℃下可保存一年以上)、低滲漏、緩釋作用(可延遲釋放數天至數周)。因其非同心圓的拓樸結構，使得多泡脂質體在注射部位形成藥物“儲庫”，隨著磷脂雙分子層的不斷代謝，包封在囊泡中的藥物逐步釋放至血液或病變部位，發揮很好的延遲釋放作用。通過調節制備過程中的參數和處方比例，可以輕松控制藥物釋放時間在幾天到數周之間。
然而，目前存在的問題是由于不同的藥物活性成分有不同的理化性質和作用機理，其制備包封率和藥物釋放有較大差異，因此針對具體藥物及其釋放要求，需研究采用特定的處方和工藝。
發明內容
本發明要解決的技術問題即為上述課題，提供一種具有緩釋作用的草烏甲素多泡脂質體及其制備方法。
本發明的技術方案包括一種草烏甲素多泡脂質體的制備方法，其可以包括下列步驟①將脂質成分溶于有機溶劑中，以作為脂質相，其中該脂質成分包括重量比為2∶1～4∶1的中性磷脂和膽固醇，以及在脂質成分中占摩爾百分比為2～6％的中性脂質，該中性磷脂在脂質相中的濃度為20～40mg/ml；②將草烏甲素溶于稀酸溶液中使其濃度為20μg/ml～5000μg/ml，以作為內水相；③將等體積的所述內水相加入脂質相上層，混合乳化制得油包水型初乳；④將2～6倍體積的外水相加入所述油包水型初乳的上層，攪拌形成水包油包水型(W/O/W)復乳，其中外水相中含有40mM的氨基酸、以及3.2～6g/100ml的滲透壓調節物；⑤除去步驟④得到的復乳中的有機溶劑而制得草烏甲素多泡脂質體。
其中，上述中性磷脂及膽固醇為成膜材料。膽固醇為膜穩定劑，可通過改變磷脂相轉變溫度調節脂質體膜層的流動性，從而改善脂質體的穩定性，減小貯存過程中因脂質體膜層相變引起的藥物滲漏。膽固醇用量過小，其調節作用甚微，當用量過大時難以形成脂質體的磷脂雙分子層，研究表明當磷脂與膽固醇重量比在2∶1～4∶1之間時形成的脂質體最穩定。
本發明步驟①中所述的中性磷脂是指處于其等電點時凈電荷為零的磷脂，其選自卵磷脂、大豆磷脂、腦磷脂、鞘磷脂、氫化大豆磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)、二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)、磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)等天然和合成磷脂中的一種或幾種；本發明優選自卵磷脂、二油酰磷脂酰膽堿和二油酰磷脂酰乙醇胺。
而本發明所說的中性脂質是指本身沒有形成囊泡能力的，并且缺少帶電荷的或親水的“頭部”基團的油或脂肪，如三油酸甘油酯、三月桂酸甘油酯、三癸酸甘油酯、三辛酸甘油酯、三己酸甘油酯、維生素E和角鯊烯中的一種或幾種。中性脂質在脂質體中主要起支架作用，分布于非同心水性腔室磷脂雙分子層節點處，支撐起多泡(多囊)脂質體的拓撲結構；其是形成多泡(多囊)脂質體的決定性因素之一。本發明優選三油酸甘油酯。
該有機溶劑可為能溶解脂質成分的任何溶劑，通常選自乙醚、氯仿、二氯甲烷、異丙基乙醚、四氫呋喃、鹵代醚和鹵代酯中的一種或幾種。本發明優選二氯甲烷或乙醚-氯仿混合物。更佳為二氯甲烷，因二氯甲烷可有效溶解磷脂和類脂，并且毒性低于氯仿，揮干速率更優。
該步驟①的脂質成分中還可以含有帶負電荷或正電荷的類脂，帶電荷類脂可有效調節脂質體表面電荷，使脂質體帶負電或正電，以增強制劑穩定性。該類脂與中性磷脂的重量比可為1∶5～1∶60，類脂用量太少作用不明顯，太多則增加成本，本發明優選1∶5～1∶20。本發明所述的帶負電荷的類脂選自磷脂酰絲氨酸、二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸(DPPS)、二硬脂酰磷脂酰絲氨酸(DSPS)、磷脂酰甘油、二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、磷脂酰肌醇、二棕櫚酰磷脂酰肌醇(DPPZ)、二硬脂酰磷脂酰肌醇(DSPZ)、磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酸(DPPA)及二硬脂酰磷脂酸(DSPA)中的一種或幾種；而所述帶正電荷的類脂選自二酰基三甲胺丙烷、二酰基二甲胺丙烷、硬脂胺(SA)及膠原蛋白中的一種或幾種。
草烏甲素為生物堿類，其在水中溶解度較小，而易溶于氫鹵酸(如鹽酸等)、硫酸、乙酸等酸性溶液中，最常規使用的為0.1M的稀鹽酸溶液。由于草烏甲素在酸性溶液中帶正電，當脂質體表面帶負電荷時更有利于草烏甲素的包封，從而提高草烏甲素脂質體的包封率。因此本發明的類脂優選磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸和二棕櫚酰磷脂酰甘油等帶負電荷的類脂中的一種或幾種。
較佳地，步驟②的內水相中草烏甲素的濃度為500～1000μg/ml。
步驟②的內水相中還可以加入不超過10g/100ml，一般不超過4g/100ml的滲透壓調節物，以進一步增強制劑穩定性。
步驟④中的氨基酸可選用賴氨酸、精氨酸等，可增加產品的穩定性。
本發明所述滲透壓調節物可為現有技術中常用于調節滲透壓的物質，如葡萄糖、蔗糖、甘露醇、麥芽糖等碳水化合物類，以及氯化鈉等。本發明優選葡萄糖和/或蔗糖。
上述步驟③中所述混合乳化可采用現有技術，如通過攪拌、振蕩、聲處理、超聲波、高速剪切勻漿機等裝置和方法來處理；本發明優選采用高速剪切勻漿機。
而上述步驟④中混合形成復乳和步驟⑤中的去除溶劑方法均可采用現有技術，其中去除溶劑方法包括但不僅限于氣流吹干、減壓蒸發等，通常選用氮氣、氦氣、氬氣等惰性氣體及氫氣、二氧化碳等氣體吹干溶劑，最常用且成本低的是氮氣吹干。
本發明還提供一種草烏甲素多泡脂質體，其是由上述制備方法制得。
本發明的草烏甲素多泡脂質體具有高的包封率，在體內、外試驗中均顯示有良好的緩釋作用，從而較現有制劑有更佳的止痛效果，并由此降低了用藥次數及總用藥量。
圖1為本發明草烏甲素多泡脂質體的體外釋放-時間曲線圖。
具體實施例方式
下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明并不受其限制。
下面實施例中草烏甲素多泡脂質體粒徑采用顯微鏡檢測；包封率測定方法為取0.5mL本發明草烏甲素多泡脂質體混懸液，加入4.5mL生理鹽水，混和均勻，600×g離心5分鐘，分離上清液和沉淀。依據已建立的分析方法(中國藥典2005版二部)檢測上清液中游離草烏甲素濃度；將沉淀用10％的Triton X-100溶液破膜溶解，依法測定包封的草烏甲素的濃度，用以下公式計算草烏甲素多泡脂質體的包封率包封率(％)＝被包封的草烏甲素量/混懸液中草烏甲素總量×100實施例1步驟1精密稱取卵磷脂200mg、膽固醇50mg、磷脂酰甘油40mg和三油酸甘油酯17.4mg，用5ml二氯甲烷溶解，作為脂質相；步驟2精密稱取5mg草烏甲素和蔗糖100mg，用適量鹽酸溶液(0.1mol/L)超聲溶解，并定容至5ml，作為內水相，緩慢加入脂質相上層；步驟3用高速剪切勻漿機(Fluko，ATS工業系統有限公司)將步驟2所得混合物在10000rpm的轉速下作用9分鐘，制得W/O型初乳；步驟4為制得二氯甲烷微球混懸液，將20mL含有3.2％(g/ml)葡萄糖和40mM賴氨酸的外水相加在W/O型初乳的上層，以4500rpm的轉速作用15秒鐘，形成二氯甲烷微球的混懸液；步驟5為制得多泡脂質體，將上述混懸液注入盛有30mL外水相的1000mL錐形瓶中，通以氮氣(8L/min)，37℃水浴20分鐘緩慢除去二氯甲烷；向錐形瓶中加入60mL生理鹽水，在600×g條件下離心5分鐘分離脂質體，棄上清液，用生理鹽水洗滌沉淀三次，將所得沉淀再分散在5～10ml生理鹽水中，得多泡脂質體混懸液。
測得草烏甲素多泡脂質體粒徑為5～50μm；包封率為95.7％。
實施例2步驟1精密稱取卵磷脂200mg、膽固醇50mg、磷脂酸10mg和三油酸甘油酯15.6mg，用5ml二氯甲烷溶解，作為脂質相；步驟2精密稱取5mg草烏甲素和蔗糖200mg，用適量鹽酸溶液(0.1mol/L)超聲溶解，并定容至5ml，作為內水相，緩慢加入脂質相上層；步驟3同實施例1；步驟4為制得二氯甲烷微球混懸液，將20mL含有6.0％(g/ml)葡萄糖和40mM賴氨酸的外水相加在W/O型初乳的上層，以4500rpm的轉速作用15秒鐘，形成二氯甲烷微球的混懸液；步驟5同實施例1。
測得草烏甲素多泡脂質體粒徑為5～50μm；包封率為79.1％。
實施例3步驟1精密稱取二油酰磷脂酰膽堿100mg、膽固醇50mg、磷脂酰絲氨酸20mg和三油酸甘油酯3.4mg，用5ml氯仿-乙醚混合物(體積比為1∶1)溶解，作為脂質相；步驟2精密稱取2.5mg草烏甲素，用適量鹽酸溶液(0.1mol/L)超聲溶解，并定容至5ml，作為內水相，緩慢加入脂質相上層；步驟3同實施例1；步驟4為制得氯仿-乙醚微球混懸液，將60mL含有3.2％(g/ml)葡萄糖和40mM賴氨酸的外水相加在W/O型初乳的上層，以4500rpm的轉速作用15秒鐘，形成氯仿-乙醚微球的混懸液；步驟5同實施例1。
測得草烏甲素多泡脂質體粒徑為5～50μm；包封率為87.9％。
實施例4
步驟1精密稱取二油酰磷脂酰乙醇胺150mg、膽固醇50mg、磷脂酰甘油15mg和三油酸甘油酯7.5mg，用5ml氯仿-乙醚混合物(體積比為1∶1)溶解，作為脂質相；步驟2精密稱取3.75mg草烏甲素、100mg蔗糖，用適量鹽酸溶液(0.1mol/L)超聲溶解，并定容至5ml，作為內水相，緩慢加入脂質相上層；步驟3同實施例1；步驟4為制得氯仿-乙醚微球混懸液，將40mL含有5.7％(g/ml)葡萄糖和40mM賴氨酸的外水相加在W/O型初乳的上層，以4500rpm的轉速作用15秒鐘，形成氯仿-乙醚微球的混懸液；步驟5同實施例1。
測得草烏甲素多泡脂質體粒徑為5～50μm；包封率為81.8％。
實施例5步驟1精密稱取卵磷脂200mg、膽固醇100mg、二棕櫚酰磷脂酰甘油40mg和三油酸甘油酯20.4mg，用5ml二氯甲烷溶解，作為脂質相；步驟2精密稱取5mg草烏甲素和蔗糖100mg，用適量鹽酸溶液(0.1mol/L)超聲溶解，并定容至5ml，作為內水相，緩慢加入脂質相上層；步驟3同實施例1；步驟4為制得二氯甲烷微球混懸液，將20mL含有3.2％(g/ml)葡萄糖和40mM賴氨酸的外水相加在W/O型初乳的上層，以4500rpm的轉速作用15秒鐘，形成二氯甲烷微球的混懸液；步驟5同實施例1。
測得草烏甲素多泡脂質體粒徑為5～50μm；包封率為89.3％。
實施例6步驟1精密稱取卵磷脂120mg、膽固醇30mg和三油酸甘油酯1.6mg，用5ml二氯甲烷溶解，作為脂質相；步驟2精密稱取5mg草烏甲素和葡萄糖200mg，用適量乙酸溶液(0.1mol/L)超聲溶解，并定容至5ml，作為內水相，緩慢加入脂質相上層；步驟3～5同實施例1。
測得草烏甲素多泡脂質體粒徑為5～50μm；包封率為72.8％。
實施例7步驟1精密稱取卵磷脂200mg、膽固醇100mg、磷脂酰甘油40mg和三油酸甘油酯20.4mg，用5ml二氯甲烷溶解，作為脂質相；步驟2精密稱取25mg草烏甲素和蔗糖100mg，用適量鹽酸溶液(0.1mol/L)超聲溶解，并定容至5ml，作為內水相，緩慢加入脂質相上層；步驟3同實施例1；步驟4為制得二氯甲烷微球混懸液，將20mL含有4％(g/ml)蔗糖和40mM精氨酸的外水相加在W/O型初乳的上層，以4500rpm的轉速作用15秒鐘，形成二氯甲烷微球的混懸液；步驟5同實施例1。
測得草烏甲素多泡脂質體粒徑為5～50μm；包封率為78.3％。
實施例8步驟1精密稱取卵磷脂200mg、膽固醇100mg、硬脂胺40mg和三油酸甘油酯20.4mg，用5ml二氯甲烷溶解，作為脂質相；步驟2精密稱取5mg草烏甲素和蔗糖100mg，用適量鹽酸溶液(0.1mol/L)超聲溶解，并定容至5ml，作為內水相，緩慢加入脂質相上層；步驟3同實施例1；步驟4為制得二氯甲烷微球混懸液，將20mL含有4％(g/ml)蔗糖和40mM精氨酸的外水相加在W/O型初乳的上層，以4500rpm的轉速作用15秒鐘，形成二氯甲烷微球的混懸液；步驟5同實施例1。
測得草烏甲素多泡脂質體粒徑為5～50μm；包封率為60.9％。
上述實施例中所用卵磷脂為德固賽公司產品；二油酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸和二棕櫚酰磷脂酰甘油購于Sigma公司；硬脂胺購于Fluka公司；膽固醇購于上海藍季科技發展有限公司；三油酸甘油酯購于廣州化學試劑廠；其余試劑均為常規市售產品。
試驗實施例1草烏甲素多泡脂質體的體外釋放測定取實施例1的草烏甲素多泡脂質體混懸液20ml，用80ml生理鹽水稀釋，將所得混懸液置于37℃恒溫搖床(轉速為15rpm)中，在預定的時間點取出等量的樣品，以600×g離心分離上清液和沉淀，依法測定上清液中草烏甲素的量，每個時間點的藥物釋放百分比用以下公式計算藥物釋放百分比(％)＝上清液中游離草烏甲素的量/多泡脂質體中包封的草烏甲素原始量×100結果表明在第6天(144小時)時，藥物釋放達到了80％以上，包封的草烏甲素基本釋放完全(如圖1所示)。說明本發明草烏甲素的多泡脂質體具有明顯的緩釋效果。
試驗實施例2草烏甲素多泡脂質體藥效試驗取昆明種小鼠若干，雌雄各半，隨機分成3組，每組10只。一組給生理鹽水作為對照(對照組)，一組給草烏甲素注射液(試驗組1)，劑量0.04mg/kg，一組給實施例1制得的草烏甲素多泡脂質體(試驗組2)，劑量以草烏甲素計為0.04mg/kg。首先，每組每只動物分別腹腔注射0.6％醋酸0.2ml致痛，5分鐘后分別皮下注射給予上述藥物，觀察動物扭體情況；其次于第2、3、4、5、6、7天再分別腹腔注射0.6％醋酸0.2ml致痛，觀察每組動物扭體情況。結果如下表1[抑制率＝(生理鹽水組小鼠扭體數-試驗組小鼠扭體數)/生理鹽水組小鼠扭體數×100％]。
表1草烏甲素多泡脂質體對小鼠化學致痛的抑制率(％)
權利要求
1.一種草烏甲素多泡脂質體的制備方法，其包括下列步驟①將脂質成分溶于有機溶劑中，以作為脂質相，其中該脂質成分包括重量比為2∶1～4∶1的中性磷脂和膽固醇，以及在脂質成分中占摩爾百分比為2～6％的中性脂質，該中性磷脂在脂質相中的濃度為20～40mg/ml；②將草烏甲素溶于稀酸溶液中使其濃度為20μg/ml～5000μg/ml，以作為內水相；③將等體積的所述內水相加入脂質相上層，混合乳化制得油包水型初乳；④將2～6倍體積的外水相加入所述油包水型初乳的上層，混合形成水包油包水(W/O/W)型復乳，其中外水相中含有40mM的氨基酸、以及3.2～6g/100ml的滲透壓調節物；⑤除去步驟④得到的復乳中的有機溶劑而制得草烏甲素多泡脂質體。
2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于該步驟①中所述的脂質成分中還含有帶負電荷或正電荷的類脂，該類脂與中性磷脂的重量比為1∶5～1∶20。
3.如權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述帶負電荷的類脂選自磷脂酰絲氨酸、二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸、二硬脂酰磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、二棕櫚酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、二棕櫚酰磷脂酰肌醇、二硬脂酰磷脂酰肌醇、磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酸及二硬脂酰磷脂酸中的一種或幾種；所述帶正電荷的類脂選自二酰基三甲胺丙烷、二酰基二甲胺丙烷、硬脂胺及膠原蛋白中的一種或幾種。
4.如權利要求3所述的制備方法，其特征在于該類脂為選自磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸和二棕櫚酰磷脂酰甘油中的一種或幾種帶負電荷的類脂。
5.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟①中的中性磷脂選自卵磷脂、大豆磷脂、氫化大豆磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、腦磷脂、鞘磷脂中的一種或幾種；該中性脂質選自三油酸甘油酯、三月桂酸甘油酯、三癸酸甘油酯、三辛酸甘油酯、三己酸甘油酯、維生素E和角鯊烯中的一種或幾種；該有機溶劑選自乙醚、氯仿、二氯甲烷、異丙基乙醚、四氫呋喃、鹵代醚和鹵代酯中的一種或幾種。
6.如權利要求5所述的制備方法，其特征在于該中性磷脂選自卵磷脂、二油酰磷脂酰膽堿和二油酰磷脂酰乙醇胺，該中性脂質為三油酸甘油酯，該有機溶劑為二氯甲烷或乙醚-氯仿混合物。
7.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟②中所述的草烏甲素的濃度為500～1000μg/ml。
8.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟②中所述的內水相中還可以加入＞0g/100m1，且≤4g/100ml的滲透壓調節物。
9.如權利要求1或8所述的制備方法，其特征在于所述滲透壓調節物為葡萄糖和/或蔗糖。
10.如權利要求1～8任一項所述的制備方法制得的草烏甲素多泡脂質體。
全文摘要
本發明公開了一種草烏甲素多泡脂質體及其制備方法，該制備方法包括下列步驟①將包括中性磷脂、膽固醇和中性脂質的脂質成分溶于有機溶劑中，使中性磷脂含量為20～40mg/ml，以作為脂質相；②將草烏甲素溶于稀酸溶液中使其濃度為20μg/ml～5000μg/ml，以作為內水相；③將等體積的所述內水相加入脂質相上層，混合乳化制得油包水型初乳；④將含有滲透壓調節物的外水相加入所述油包水型初乳的上層，攪拌形成水包油包水型復乳；⑤除去復乳中的有機溶劑而制得草烏甲素多泡脂質體。該草烏甲素多泡脂質體具有較高的包封率，并有較佳的緩釋作用，而取得更佳的止痛效果。
文檔編號A61K9/127GK101040853SQ20061002492
公開日2007年9月26日 申請日期2006年3月22日 優先權日2006年3月22日
發明者陸偉根, 任德權, 陳亭亭 申請人:上海醫藥工業研究院