專利名稱：一種草烏甲素多囊脂質體及其制備方法
技術領域：
本發明涉及緩釋制劑領域，特別涉及一種草烏甲素多囊脂質體及其制備方法。
背景技術：
草烏甲素(Bulleyaconitine A)是從我國云南烏頭屬植物滇西嘟拉(Aconitum
bulleyanum Diels)中分離得到的一種具有顯著鎮痛作用的生物堿(即滇西嘟拉堿)，其相
對鎮痛作用為嗎啡的15倍，阿司匹林的1208倍，且連續用藥不產生鎮痛作用耐受，是一種
不同于嗎啡類的非成癮性鎮痛劑。該藥現有片劑、口服液、膠囊和注射劑。其中片劑、口服
液已為現行版中國藥典收載。由于草烏甲素半衰期較短，因此現有制劑臨床使用均需多次
給藥，患者依從性差，且鎮痛作用短而影響療效，開發其緩釋制劑是臨床所需。 脂質體是一種定向藥物載體，屬于靶向給藥系統的一種新劑型。它可以將藥物粉
末或溶液包埋在直徑為納米級的微粒中，這種微粒具有類細胞結構，進入人體內主要被網
狀內皮系統吞噬而激活機體的自身免疫功能，并改變被包封藥物的體內分布，使藥物主要
在肝、脾、肺和骨髓等組織器官中積蓄，從而提高藥物的治療指數，減少藥物的治療劑量和
降低藥物的毒性。 現有的普通脂質體的制備包括主動載藥法和被動載藥法兩種。其中的主動載藥法 也稱為遙控包封裝載技術，能夠將某些特殊性質的藥物選擇性地擴散，并富集到脂質體內 水相。其基本原理是(l)脂質體磷脂雙份子層可以選擇性將脂質體內外的水溶性物質，包 括正電荷的質子和鉀/鈉等各種離子有效地分隔開，形成脂質體內外相對獨立的環境；(2) 親脂性的弱酸或弱堿性化合物在非離子狀態呈脂溶性，可以嵌入磷脂雙份子層，并依據離 子梯度透過磷脂膜進入脂質體內水相。Nichols和Deamer很早就提出了離子梯度的概念， 他們在早期研究中觀察到，如果在脂質體的內外形成pH梯度，且使脂質體內水相為酸性， 能使得兒茶酚胺高效分離并聚集到酸性的脂質體內。相反，當脂質體內水相為堿性時，親脂 性的弱酸性化合物就會向堿性的脂質體內部聚集。 多囊脂質體是基于脂質體的緩釋藥物傳遞系統，被用于局部、區域和系統藥物傳 遞。多囊脂質體還被稱為多泡脂質體或多室脂質體，是含有多個非同心腔室的脂質體顆粒， 形狀類似于脂質體顆粒，這種顆粒的結構區別于含有多個同心腔室的多室脂質體，又區別 于只含有單個內水相腔室的單室脂質體。許多水溶性藥物可包封于多囊脂質體中，通過動
物鞘內、皮下、腹腔和硬膜外給藥，人體腦室內、鞘內、皮下、硬膜外給藥都顯示出了緩釋作用。 Kim. S等人于1983年最先發現并研究了多囊脂質體。他們通過復乳溶劑蒸發法， 以磷脂、膽固醇和中性脂質為成膜材料，以氯仿和乙醚為有機溶劑，成功制備了多囊脂質 體，并憑借光學顯微鏡和電鏡觀察了多囊脂質體的微觀結構。在制備過程中，首先將藥物溶 液和脂質相在機械作用力下形成油包水型乳液，再將此乳液與外水相混合制得復乳，然后 氮氣吹干除去有機溶劑而制得多囊脂質體混懸液。 CN ZL95196186. 1也公開了一種活性藥劑控制釋放的多囊脂質體的制備。因其非同心圓的拓樸結構，使得多囊脂質體在注射部位形成藥物"儲庫"，隨著磷脂雙分子層的不 斷代謝，包封在囊泡中的藥物逐步釋放至血液或病變部位，發揮很好的延遲釋放作用。通過 調節制備過程中的參數和處方比例，可以輕松控制藥物釋放時間在幾天到數周之間。通過 復乳法制備的多囊脂質體顆粒的平均粒徑在5 50ym之間，包封率20% 90%，但是該 多囊脂質體的制備方法藥物利用率低，穩定性較差。 現有的多囊脂質體的制備方法均屬于上述的被動載藥法，而不是主動載藥法。本 申請人:的專利申請200610024926. X公開了一種草烏甲素多囊脂質體，但是其也是被動載 藥法制備的。該法原料利用率較低，藥物利用率通常小于40%。
發明內容
因此，本發明要解決的問題就是提供一種草烏甲素多囊脂質體及其制備方法。該 草烏甲素多囊脂質體，包封的活性物質——草烏甲素的原料利用率高，載藥濃度高，穩定性 好。 本發明人經過廣泛的研究和試驗，驚喜地發現用跨膜梯度主動載藥法也可以制 備多囊脂質體，而且該方法中草烏甲素利用率高，多囊脂質體穩定性好，是一種制備草烏甲 素多囊脂質體的好方法，從而完成了本發明。 因此，本發明解決上述問題所采用的技術方案之一是一種草烏甲素多囊脂質體， 包括藥物活性成分草烏甲素和空白多囊脂質體作為載體，所述的空白多囊脂質體包括下列 質量份的各組分脂質成分1份和離子梯度調節劑0. 1 50份，其中脂質成分中包括摩爾 比為5 36 : 1的兩親性脂質和中性脂質。 根據本發明，所述的草烏甲素多囊脂質體中，藥脂比較佳的是i : io i : ioo，ooo，更佳的為i : ioo i : iooo。本發明中，所述的"藥脂比"是指藥物活性成 分草烏甲素與多囊脂質體中的脂質成分的質量比。 本發明中，所述的空白多囊脂質體較佳的包括下列質量份的各組分脂質成分1 份和離子梯度調節劑0.5 20份，其中脂質成分中包括摩爾比10 20 : l的兩親性脂質
和中性脂質。 本發明中，所述的"兩親性脂質"是指具有親水和親油兩種性質的類脂成份，主要
是指磷脂，是構成脂質體的主要成份。兩親性脂質較佳的為選自卵磷脂、大豆磷脂、氫化大 豆磷脂、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、硬脂胺、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、磷脂酰 乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、腦磷脂、鞘磷脂、二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂 酰肌醇、磷脂酸和二棕櫚酰磷脂酰甘油中的一種或幾種。 本發明中，所述的"中性脂質"是指親油性類脂，本身不能形成脂質體，需與兩親性
脂質一起構成脂質體。中性脂質是形成多囊脂質體拓撲結構的決定性因素之一。其在脂質 體中主要起支架作用，分布于非同心水性腔室磷脂雙分子層節點處，支撐起多囊脂質體的 拓撲結構。中性脂質較佳的為選自三油脂、三辛脂、大豆油、豬/牛油脂、生育酚和角鯊烯中 的一種或幾種。 本發明中，所述"離子梯度調節劑"是指用于形成脂質體內外離子梯度的物質。所
述的離子梯度調節劑較佳的選自硫酸銨、硫酸銅、硫酸錳、硫酸鎂、醋酸鈣、檸檬酸和二氯化 錳中的一種或幾種。
本發明中，所述的脂質成份中，較佳的還可以進一步包括固醇，所述的固醇較佳的 為膽固醇。固醇可通過改變中性脂質相轉變溫度調節脂質體膜層的流動性，從而改善脂質 體的穩定性和體內體外的釋放速率。因此，固醇通常被認為是膜穩定劑。固醇的用量對多 囊脂質體的穩定性和釋放行為有顯著的影響。本發明中，較佳的，所述的固醇與脂質成分中 的中性脂質的摩爾比為0.7 65 : 1，較佳的為2 8 : l，所述的百分比為其在脂質成分 中所占的摩爾百分比。 本發明中，所述的空白多囊脂質體還進一步包含滲透壓調節劑。本發明中，所述的
"滲透壓調節劑"是指用于調節溶液滲透壓的物質，可為本領域現有技術中常用的物質，如
海藻糖、琥珀酸鹽、環糊精、精氨酸、半乳糖、甘露糖、麥芽糖、甘露糖醇、甘氨酸、賴氨酸、擰
檬酸鹽、山梨醇和葡聚糖等，較佳的選自葡萄糖、蔗糖、甘露醇和氯化鈉中的一種或幾種。滲
透壓調節劑的含量較佳的為0. 08 15份(相對于脂質成分為1質量份的情況)。 本發明解決上述問題所采用的技術方案之二是一種如上所述草烏甲素多囊脂質
體的制備方法，包括以下步驟 ①將脂質成份溶于有機溶劑中作為脂質相，該脂質成分包括兩親性脂質和中性脂 質； ②將離子梯度調節劑溶解于水中，作為內水相，將所述內水相加入脂質相，混合乳 化制得油包水(W/0)型初乳； ③將外水相加入所述油包水型初乳中，混合形成水包油包水(W/0/W)型復乳；
④除去步驟③得到的復乳中的有機溶劑，制得空白多囊脂質體混懸液初品；
⑤用等滲溶液洗滌所述空白多囊脂質體混懸液初品，再分散于等滲溶液中，制得 空白多囊脂質體成品； ⑥將草烏甲素和滲透壓調節劑溶解于水中； ⑦將步驟⑥所得的溶液和步驟⑤所得的空白多囊脂質體成品混合，在高于脂質的 相轉變溫度孵育，制得草烏甲素多囊脂質體混懸液初品； ⑧用等滲溶液洗滌所述草烏甲素多囊脂質體混懸液初品，再分散于等滲溶液中， 制得草烏甲素多囊脂質體成品。 本發明中，步驟①為將脂質成份溶于有機溶劑中作為脂質相，該脂質成分包括兩 親性脂質和中性脂質。其中，所述的有機溶劑可為能溶解脂質成分的任何溶劑，較佳的為選
自醚、烴、鹵代烴、鹵代醚和酯中的一種或幾種，更佳為氯仿，或者為氯仿和乙醚的混合物。 該脂質相中，較佳的，兩親性脂質的濃度為5 120mM，兩親性脂質和中性脂質的摩爾比為 5 36 : 1。 本發明中，步驟②為將離子梯度調節劑溶解于水中，作為內水相，將所述內水相加 入脂質相，混合乳化制得油包水(W/0)型初乳。 其中，所述離子梯度調節劑選自硫酸銨、硫酸銅、硫酸錳、硫酸鎂、醋酸鈣、檸檬酸 和二氯化錳中的一種或幾種。離子梯度調節劑在內水相中的濃度較佳的為10 1000mM，更 佳的為50 500mM。本發明內水相中的離子梯度調節劑使本發明所得的空白多囊脂質體 內外產生了離子梯度。在主動載藥法制備普通脂質體的工藝中，常用的離子梯度包括pH梯 度、硫酸銨梯度和離子梯度_細胞離子載體。硫酸銨梯度法以及其他離子梯度法能夠將藥 物載入脂質體內部的最根本原動力都可以歸結為pH梯度的作用，只不過pH梯度的產生方法有直接和間接的區別。本發明所適用的離子梯度也包括如上三種，是通過步驟②所述的 離子梯度調節劑建立的。空白多囊脂質體內外的離子梯度建立后，就可以利用該離子梯度 產生的動力，將藥物活性成分草烏甲素主動載入該空白多囊脂質體中，從而制得草烏甲素 多囊脂質體。 內水相中可以不含滲透壓調節劑，因為離子梯度調節劑本身就可以造成滲透壓， 當離子梯度調節劑濃度不夠大時，就需要滲透壓調節劑來調節滲透壓。滲透壓調節劑可為 本領域任何常用的用于調節溶液滲透壓的物質。滲透壓調節劑的作用在于調節內水相的滲 透壓等于人體血漿的滲透壓，這樣可以保證本發明的多囊脂質體被注入人體后保持穩定， 并調節藥物自多囊脂質體釋放至體內的速率。滲透壓調節劑在內水相中的濃度可以為1 1000mM，較佳的為50 200mM。 該步驟②制備油包水(W/0)型初乳的方法為本領域的常規技術，采用選自機械攪 拌、超聲和噴霧干燥的方法進行乳化。其中較佳的，所述的內水相和脂質相的體積比較佳的
為i : i i : 4，更佳的為i : i i : 2。 本發明中，步驟③為將外水相加入所述油包水型初乳中，混合形成水包油包水(W/ 0/W)型復乳。其中，較佳的，所述的外水相中包含輔助乳化劑和滲透壓調節劑。輔助乳化
劑可以為選自賴氨酸、甘氨酸和組氨酸中的一種或幾種。在外水相中，輔助乳化劑濃度較佳
的為20 80mM，更佳的為30 60mM。滲透壓調節劑也可以為本領域任何常用的用于調 節溶液滲透壓的物質。滲透壓調節劑使本發明的空白多囊脂質體的外水相的滲透壓保持 與內水相相等，即為人體血漿的滲透壓。在該外水相中，滲透壓調節劑的濃度較佳的可以為 0. 01 50% (w/v)，更佳的為0. 1 10% (w/v)。該所述的制備水包油包水(W/0/W)型復 乳的方法為本領域的常規技術，采用選自機械攪拌、超聲和噴霧干燥的方法進行乳化。所述
的油包水型初乳和外水相的體積比較佳的為i : 2.5 i : io，更佳的為i : 3 i : 5。 本發明中，步驟④為除去步驟③得到的復乳中的有機溶劑，制得空白多囊脂質體
混懸液初品。其中，除去有機溶劑的方法為本領域的常規的溶劑去除法，較佳的為氣流吹 干、旋轉減壓蒸發或噴霧干燥，其中氣流吹干法所用氣體可選自氮氣、氦氣、氬氣、氧氣、氫 氣和二氧化碳。 本發明中，步驟⑤為用等滲溶液洗滌所述空白多囊脂質體混懸液初品，再分散于 等滲溶液中，制得空白多囊脂質體成品。本發明中，術語"等滲溶液"是指滲透壓與人體血漿 相同的溶液，較佳的為生理鹽水。其中洗滌的目的在于去除未包封的離子梯度調節劑和滲 透壓調節劑等梯度形成物質，使脂質體內外形成足夠大的梯度差，以便更有效地加載藥物。
本發明中，步驟⑥為將草烏甲素和滲透壓調節劑溶解于水中。其中，草烏甲素的 濃度較佳的為0. 1 200ug/ml，更佳的為1 100ug/ml，更佳的為20 80ug/ml。草烏甲 素產生的滲透壓很小，需要加入滲透壓調節劑使該水溶液的滲透壓等于空白多囊脂質體的 內水相的滲透壓。滲透壓調節劑的濃度可以為1 1000mM，較佳為10 500mM，更佳的為 20 50mM。 本發明中，步驟⑦為將步驟⑥所得的溶液和步驟⑤所得的空白多囊脂質體成品混 合，在高于脂質的相轉變溫度孵育，制得草烏甲素多囊脂質體混懸液初品。其中，所述的空 白多囊脂質體包括下列質量份的各組分脂質成分1份和離子梯度調節劑0. 1 50份， 其中脂質成分中包括摩爾比為5 36 : 1的兩親性脂質和中性脂質。藥脂比較佳的為i : io i : ioo，ooo，更佳為i : ioo i : iooo。本發明中，術語"脂質的相轉變溫度" 是指脂質凝膠態和液晶態之間相互轉變時的溫度。在高于脂質的相轉變溫度孵育，可以使 磷脂膜通透性增強，使草烏甲素在離子梯度的驅動力下更易滲透過膜，聚集于多囊脂質體
的內水相中。較佳的，在高于脂質的相轉變溫度孵育的時間是1 240分鐘，更佳的是5 30分鐘。 本發明中，步驟⑧為用等滲溶液洗滌所述草烏甲素多囊脂質體混懸液初品，再分 散于等滲溶液中，制得草烏甲素多囊脂質體成品。其中，用等滲溶液洗滌的方法可以是本領 域常規的方法，可用等滲溶液作為洗滌溶液，采用離心、透析或膜濾的方法去除其中的游離 藥物，然后用等滲溶液懸浮。等滲溶液較佳的為生理鹽水。 本發明所述的草烏甲素多囊脂質體可用于制備抗腫瘤藥物，特別是用于制備抗神
經細胞瘤、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、結腸癌和食道癌的藥物。 本發明的草烏甲素多囊脂質體的給藥途徑與常規的脂質體一樣，如皮下注射、硬
膜外注射或鞘內注射等。 本發明所用的原料和試劑均市售可得。 —切以本發明為基礎的草烏甲素多囊脂質體或以主動載藥法制備的草烏甲素多 囊脂質體以及它們的制備方法都在本發明的范圍之內。 相比于現有技術，本發明的有益效果如下本發明采用包封有梯度調節劑的空白 多囊脂質體，通過跨膜梯度主動載藥法將草烏甲素透過磷脂膜進入空白多囊脂質體內水 相，得到了載有藥物活性成分草烏甲素的具有緩釋效果的多囊脂質體。本發明包封的活性 物質——草烏甲素的原料利用率高，可大大較少藥物的浪費，從而降低成本。本發明的草烏 甲素多囊脂質體載藥濃度高，藥物利用率高，穩定性好，在體內、體外試驗中均顯示有良好 的緩釋作用，從而降低用藥次數和用藥總量，減少不良反應，必然較現有制劑有更佳的抗腫 瘤效果。
以下結合
本發明的特征和優點。
圖1是本發明草烏甲素多囊脂質體體外釋放的藥時曲線。
具體實施例方式
下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明并不受其限制。下列實施例中未注 明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例中由摩爾比換算得到的物料的重量投料，由于磷脂多為混合物，故在計算 時取其大約分子量。涉及到的物質的分子量如下卵磷脂750、氫化大豆磷脂790、磷脂酸 424.5、硬脂胺269.5、膽固醇387、三油酸甘油酯885、三辛酸甘油脂470、磷脂酰甘油740、二 棕櫚酰磷脂酰甘油745、二油酰磷脂酰膽堿786、二油酰磷脂酰乙醇胺744、磷脂酰肌醇859、 二棕櫚酸酰磷脂酰絲氨酸733、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿678、磷脂酰乙醇胺744，鞘磷脂731 。
實施例中所用主要試劑的生產廠商如下卵磷脂，Degussa ;二棕櫚酸磷脂酰絲氨 酸，Degussa ;磷脂酰甘油，Degussa ;二棕櫚酰磷脂酰甘油，Degussa ;二油酰磷脂酰膽堿， Degussa;草烏甲素，云南和泰藥業有限公司；擰檬酸，中國醫藥集團上海化學試劑公司；膽固醇，國藥集團化學試劑有限公司；三油酸甘油脂，廣州化學試劑廠。
藥物利用率測定方法為 精密量取脂質體混懸液lmL至5mL量瓶中，加生理鹽水至刻度，搖勻，得稀釋液。精密量取稀釋液lmL至5mL量瓶中，加Triton X-100(10wt% )至刻度，超聲15分鐘，測定總藥量；另取稀釋液適量，600Xg離心10分鐘分離上清液，精密量取上清液lmL至5mL量瓶中，加TritonX-100(10wtX )至刻度，超聲15分鐘，測定游離藥量。按下列公式計算藥物利用率 藥物利用率(％ )=(總藥量_游離藥量)/總藥量* 100。
藥物-膽固醇比率的測試方法為 按照上述"藥物利用率測定方法"中的步驟配制樣品，測定總藥量、游離藥量、總膽固醇量、游離膽固醇量。按下列公式計算藥物-膽固醇比率 藥物_膽固醇比率(％)=[(總藥物量-游離藥量)X磷脂分子量]/[(總膽固醇量_游離膽固醇量)X膽固醇分子量]。
Zeta電位測定方法為 取多囊脂質體混懸液適量，加生理鹽水稀釋，用ZW380型粒度儀(PCS，光子相關光
譜技術)測定。
實施例1 步驟1 :在干凈的玻璃容器中加入lmL含有19. 8mM(14. 85mg)卵磷月旨，4. 2mM(3. 13mg) 二棕櫚酰磷脂酰甘油，30mM(11. 61mg)膽固醇和3. 75mM(3. 32mg)三油酸甘油酯的氯仿溶液。該溶液稱為脂質相。 步驟2 :將溶解有120mM(15. 86mg)硫酸銨的水溶液的內水相lmL加入上述盛有脂質相的玻璃容器中，用高速剪切機以10， OOOrpm的速度攪拌10分鐘，得W/0型初乳。
步驟3 :將5mL含有5% (w/v) (250mg)葡萄糖和40mM(29. 36mg)賴氨酸的溶液置于初乳層上，然后以7500rpm的速度混合10秒鐘，得W/0/W型復乳。 步驟4 :將復乳轉移至盛有7mL含有5% (w/v) (350mg)葡萄糖和40mM(40. 93mg)賴氨酸的250mL錐形瓶中，37t:恒溫水浴，使8L/min的氮氣流通過錐形瓶中的懸液，15分鐘后緩慢揮干氯仿，得空白多囊脂質體初品。 步驟5 :向錐形瓶內加入5倍量的生理鹽水，然后600Xg離心10分鐘分離脂質體。棄上清液，并將沉淀物再分散于5mL生理鹽水中，再離心沉淀，如此循環操作3次，富集沉淀，得含有硫酸銨的空白多囊脂質體。 步驟6 :將空白多囊脂質體沉淀再分散于5mL草烏甲素(100ug/ml)-葡萄糖(5%，
w/v)溶液中，混合均勻，室溫(25°C )靜置2小時，得草烏甲素多囊脂質體。 測得草烏甲素多囊脂質體的粒徑為5 50 ii m ;藥物利用率為91. 85% ;藥物-膽
固醇比率為16. 54% ;zeta電位為負39. 9mV。 實施例2 步驟1 :在干凈的玻璃容器中加入lmL含有5mM(3. 96mg)氫化大豆磷脂，0. 5mM(0. 38mg) 二棕櫚酸磷脂酰絲氨酸，10mM(3. 87mg)膽固醇和O. 155mM(0. 073mg)三辛酸甘油酯的氯仿-乙醚溶液。該溶液稱為脂質相。 步驟2 :將溶解有10mM硫酸錳(0. 845mg)和6% (w/v) (600mg)蔗糖的水溶液內水相0. 5mL加入上述盛有脂質相的玻璃容器中，用高速剪切機以10， OOOrpm的速度攪拌10分 鐘，得W/0型初乳。 步驟3 :將7. 5mL含有0. 5% (w/v) (37. 5mg)甘露醇和80mM(87. 71mg)賴氨酸的溶
液置于初乳層上，然后以4500rpm的速度混合40秒鐘，得W/0/W型復乳。 步驟4 :將復乳轉移至盛有9mL含有0.5% (w/v) (45mg)甘露醇和80mM (105. 26mg)
賴氨酸的250mL錐形瓶中，37t:恒溫水浴，使8L/min的氮氣流通過錐形瓶中的懸液，15分鐘
后緩慢揮干氯仿_乙醚，得空白多囊脂質體初品。 步驟5:同實施例1。 步驟6 :將空白多囊脂質體沉淀再分散于5mL含有+A23187(鈣離子通道A23187)， 分子量為523. 6，濃度為0. 2mg/ml)、草烏甲素(2ug/ml)和甘露醇(0. 5%， w/v)水溶液中， 混合均勻，4(TC孵育5分鐘，得草烏甲素多囊脂質體。 測得草烏甲素多囊脂質體的粒徑為5 50 ii m ;藥物利用率為98. 72% ;藥物-膽 固醇比率為7. 58% ;zeta電位為負45. 7mV。
實施例3 步驟1 :在干凈的玻璃容器中加入lmL含有100mM(75mg)卵磷脂，20mM(8. 49mg)磷 脂酸，10mM(3.87mg)膽固醇和13mM(11. 51mg)三油酸甘油酯的二氯甲烷溶液。該溶液稱為 脂質相。 步驟2 :將溶解有1000mM(192. lmg)檸檬酸的水溶液內水相lmL加入上述盛有脂 質相的玻璃容器中，用高速剪切機以10， OOOrpm的速度攪拌10分鐘，得W/0型初乳。
步驟3 :將20mL含有10% (w/v) (2000mg)甘露醇和20mM(58. 48mg)賴氨酸的溶液 置于初乳層上，然后以7500rpm的速度混合20秒鐘，得W/0/W型復乳。
步驟4 :將復乳轉移至盛有22mL含有10 % (w/v) (2200mg)甘露醇和 20mM(64. 32mg)賴氨酸的1000mL錐形瓶中，37。C恒溫水浴，使8L/min的氮氣流通過錐形瓶 中的懸液，15分鐘后緩慢揮干二氯甲烷，得空白多囊脂質體初品。
步驟5:同實施例1。 步驟6 :將空白多囊脂質體沉淀再分散于5mL草烏甲素(50ug/ml)-甘露醇(10%， w/v)水溶液中，混合均勻，4t:孵育120分鐘，得草烏甲素多囊脂質體。 測得草烏甲素多囊脂質體的粒徑為5 50 ii m ;藥物利用率為94. 88% ;藥物-膽 固醇比率為9. 7% ;zeta電位為負54. 3mV。
實施例4 步驟1 :在干凈的玻璃容器中加入O. 5mL含有25mM(9.83mg) 二棕櫚酰磷脂酰 膽堿，10mM(8. 59mg)磷脂酰肌醇，5mM(0. 97mg)膽固醇、1.2mM(0. 53mg)三油酸甘油酯和 1.2mM(0.28mg)三辛酸甘油酯的氯仿-乙醚(1 : 1)溶液。該溶液稱為脂質相。
步驟2 :將溶解有350mM(23. 12mg)硫酸銨的水溶液內水相0. 5mL加入上述盛有脂 質相的玻璃容器中，用高速剪切機以10， OOOrpm的速度攪拌10分鐘，得W/0型初乳。
步驟3 :將2. 5mL含有8% (w/v) (200mg)蔗糖和60mM(21. 48mg)賴氨酸的溶液置 于初乳層上，然后以7500rpm的速度混合10秒鐘，得W/0/W型復乳。 步驟4 :將復乳轉移至盛有2. 5mL含有8% (w/v) (200mg)蔗糖和60mM(21. 48mg) 賴氨酸的250mL錐形瓶中，37t:恒溫水浴，使8L/min的氮氣流通過錐形瓶中的懸液，15分鐘后緩慢揮干氯仿_乙醚有機溶劑，得空白多囊脂質體初品。
步驟5:同實施例1。 步驟6 :將空白多囊脂質體沉淀再分散于5mL草烏甲素(200ug/ml)-蔗糖(8%，w/v)水溶液中，混合均勻，6(TC孵育30分鐘，得草烏甲素多囊脂質體。 測得草烏甲素多囊脂質體的粒徑為5 50 ii m ;藥物利用率為78. 53% ;藥物-膽固醇比率為20. 89% ;zeta電位為負55. 7mV。
實施例5 步驟1 :在干凈的玻璃容器中加入2mL含有50mM(75mg)大豆磷脂，5mM(2. 7mg)硬脂胺，50mM(38. 7mg)膽固醇和8. 4mM(7. 9mg)三辛酸甘油酯的氯仿溶液。該溶液稱為脂質相。 步驟2 :將溶解有150mM(18. 7mg)硫酸銅和葡萄糖2% (w/v) (10mg)的水溶液內水相0. 5mL加入上述盛有脂質相的玻璃容器中，用高速剪切機以13， OOOrpm的速度攪拌10分鐘，得W/0型初乳。 步驟3 :將20mL含有0. 9% (w/v) (180mg)氯化鈉禾口 40mM(116. 96mg)賴氨酸的溶
液置于初乳層上，然后以7500rpm的速度混合10秒鐘，得W/0/W型復乳。 步驟4 :將復乳轉移至盛有20mL含有0. 9 % (w/v) (180mg)氯化鈉和
40mM(116. 95mg)賴氨酸的1000mL錐形瓶中，37。C恒溫水浴，使8L/min的氮氣流通過錐形瓶
中的懸液，15分鐘后緩慢揮干氯仿有機溶劑，得空白多囊脂質體初品。 步驟5:同實施例1。 步驟6 :將空白多囊脂質體沉淀再分散于5mL草烏甲素(150ug/ml)-氯化鈉
(0.9%，w/v)水溶液中，混合均勻，3(TC孵育IO分鐘，得草烏甲素多囊脂質體。 測得草烏甲素多囊脂質體的粒徑為5 50 ii m ;藥物利用率為93. 58% ;藥物-膽
固醇比率為11. 39% ;zeta電位為負37. 8mV。 實施例6 步驟1 :在干凈的玻璃容器中加入0. 5mL含有5mM(1. 97mg) 二油酰磷脂酰膽堿，lmM(O. 73mg) 二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸，0. 625mM(0. 12mg)膽固醇和0. 27mM(0. 16mg)大豆油的氯仿-乙醚(l : l)溶液。該溶液稱為脂質相。 步驟2 :將溶解有600mM(37. 77mg) 二氯化錳的水溶液內水相0. 5mL加入上述盛有脂質相的玻璃容器中，用高速剪切機以13， OOOrpm的速度攪拌10分鐘，得W/0型初乳。
步驟3 :將5mL含有3. 5% (w/v) (175mg)葡萄糖和60mM(43. 86mg)賴氨酸的溶液置于初乳層上，然后以7500rpm的速度混合10秒鐘，得W/0/W型復乳。
步驟4 :將復乳轉移至盛有5mL含有3. 5% (w/v) (175mg)葡萄糖和60mM(43. 86mg)賴氨酸的250mL錐形瓶中，37t:恒溫水浴，使8L/min的氮氣流通過錐形瓶中的懸液，15分鐘后緩慢揮干氯仿_乙醚有機溶劑，得空白多囊脂質體初品。
步驟5:同實施例1。 步驟6 :將空白多囊脂質體沉淀再分散于5mL含有+A23187(0. 2mg/ml)、草烏甲素(50ug/ml)-葡萄糖(3.5%， w/v)水溶液中，混合均勻，55。C孵育60分鐘，得草烏甲素多囊脂質體。 測得草烏甲素多囊脂質體的粒徑為5 50 ii m ;藥物利用率為68. 29% ;藥物-膽固醇比率為22. 36% ;zeta電位為負30. lmV。
實施例7 步驟1 :在干凈的玻璃容器中加入lmL含有20mM(15mg)卵磷脂，20mM(7. 74mg)膽固醇和2.4mM(1.45mg)大豆油的氯仿溶液。該溶液稱為脂質相。 步驟2 :將溶解有125mM(16. 52mg)硫酸銨的水溶液內水相lmL加入上述盛有脂質
相的玻璃容器中，用高速剪切機以10， OOOrpm的速度攪拌10分鐘，得W/0型初乳。 步驟3 :將5mL含有5. 4% (w/v)葡萄糖(270mg)和40mM(29. 24mg)賴氨酸的溶液
置于初乳層上，然后以10， OOOrpm的速度混合10秒鐘，得W/0/W型復乳。 步驟4 :將復乳轉移至盛有5mL含有5. 4% (w/v) (270mg)葡萄糖和40mM(29. 24mg)
賴氨酸溶液的250mL錐形瓶中，37t:恒溫水浴，使8L/min的氮氣流通過錐形瓶中的懸液，15
分鐘后緩慢揮干氯仿，得空白多囊脂質體初品。
步驟5:同實施例1。 步驟6 :將空白多囊脂質體沉淀再分散于5mL含有草烏甲素(150ug/ml)生理鹽水溶液中，混合均勻，25t:孵育5分鐘，得草烏甲素多囊脂質體。測得草烏甲素多囊脂質體的粒徑為5 50iim ;藥物利用率為81. 92% ;藥物_膽固醇比率為19. 11% ;zeta電位為負llmV。
實施例8 步驟1 :在干凈的玻璃容器中加入lmL含有3mM(2mg) 二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿，2mM(1.49mg)磷脂酰乙醇胺，9mM(7. 9mg)膽固醇和lmM(O. 89mg)三油酸甘油酯的環己烷溶液。該溶液稱為脂質相。 步驟2 :將溶解有250mM(4. 4mg)醋酸f丐和8. 5% (w/v) (85mg)蔗糖的水溶液內水
相lmL加入上述盛有脂質相的玻璃容器中，用高速剪切機以10， OOOrpm的速度攪拌10分
鐘，得W/0型初乳。 步驟3:同實施例1。 步驟4:同實施例1。 步驟5:同實施例1。 步驟6 :將空白多囊脂質體沉淀再分散于5mL草烏甲素(2ug/ml)-匍萄糖(5.4%，w/v)水溶液中，混合均勻，4t:孵育120分鐘，得草烏甲素多囊脂質體。 測得草烏甲素多囊脂質體的粒徑為5 50 ii m ;藥物利用率為97. 32% ;藥物-膽固醇比率為5. 28% ;zeta電位為負35. 4mV。
實施例9 步驟1 :在干凈的玻璃容器中加入lmL含有45mM(33. 5mg) 二油酰磷脂酰乙醇胺，40mM(30mg)腦磷脂，9mM(3. 5mg)膽固醇和5mM(4. 4mg)三油酸甘油酯的氯代甲醚溶液。該溶液稱為脂質相。 步驟2 :將溶解有400mM(48mg)硫酸鎂和6. 2% (w/v) (62mg)蔗糖的水溶液內水相lmL加入上述盛有脂質相的玻璃容器中，用高速剪切機以10， OOOrpm的速度攪拌IO分鐘，得W/0型初乳。 步驟3:同實施例1。
步驟4:同實施例1。
步驟5:同實施例1。 步驟6 :將空白多囊脂質體沉淀再分散于5mL草烏甲素(100ug/ml)-葡萄糖
(5.4%，w/v)水溶液中，混合均勻，4t:孵育120分鐘，得草烏甲素多囊脂質體。 測得草烏甲素多囊脂質體的粒徑為5 50 ii m ;藥物利用率為93. 77% ;藥物-膽
固醇比率為12. 02% ;zeta電位為負67mV。 實施例10 步驟1 :在干凈的玻璃容器中加入lmL含有20mM(14. 6mg)鞘磷脂，10mM(7. 4mg)磷 脂酰甘油，50mM(19.3mg)膽固醇和2mM(1. 77mg)三油酸甘油酯的乙酸乙酯溶液。該溶液稱 為脂質相。 步驟2 :將溶解有120mM(15. 86mg)硫酸銨的水溶液的內水相lmL加入上述盛有脂 質相的玻璃容器中，用高速剪切機以10， OOOrpm的速度攪拌10分鐘，得W/0型初乳。
步驟3:同實施例1。
步驟4:同實施例1。 步驟6 :將空白多囊脂質體沉淀再分散于5mL草烏甲素(0. lug/ml)-葡萄糖
(5.4%，w/v)水溶液中，混合均勻，4t:孵育120分鐘，得草烏甲素多囊脂質體。 測得草烏甲素多囊脂質體的粒徑為5 50 ii m ;藥物利用率為99. 15% ;藥物-膽
固醇比率為3. 35% ;zeta電位為負53. 4mV。 對比例1主動載藥法制備草烏甲素普通脂質體 在茄形瓶中，加入含有400mM卵磷脂，40mM膽固醇的氯仿溶液10ml。 55。C恒溫旋 蒸除去其中的氯仿，使成磷脂膜。緩慢加入55t:的250mM的硫酸銨溶液10ml，渦旋振蕩30 分鐘，使磷脂膜完全脫落。然后在55t:恒溫超聲30分鐘，制備得到空白多囊脂質體。將所 得空白多囊脂質體依次通過0. 8、0. 45和0. 22 P m微孔濾膜，進行整粒。將整粒后的脂質體 透析，除去游離硫酸銨，透析液為生理鹽水。再加入lml的草烏甲素(200ug/ml)-葡萄糖 (5%， w/v)水溶液的，置于55t:恒溫水浴中孵化5分鐘，即可得到草烏甲素的普通脂質體。
測得草烏甲素普通脂質體的粒徑為100 150nm;藥物利用率為91.24X ;藥 物-膽固醇比率為20. 19% ;zeta電位為負41mV。
試驗實施例1 (1)草烏甲素多囊脂質體的體外釋放測定 精密量取實施例1的草烏甲素多囊脂質體混懸液5ml，用20ml生理鹽水稀釋，將 所得混懸液置于37t:恒溫搖床(轉速為15rpm)中，在預定的時間點取出等量的樣品，以 600Xg離心分離上清液和沉淀，依法測定上清液中草烏甲素的量。每個時間點的藥物釋放 百分比用以下公式計算 藥物釋放百分比(％ )=上清液中游離草烏甲素的量/多泡脂質體中包封的草烏 甲素原始量X100 (2)草烏甲素普通脂質體的體外釋放測定 精密量取對比例1的草烏甲素普通脂質體lml至經預處理的透析袋(截留分子量 為1， 4000)中，置于裝有50mL生理鹽水的燒杯中，37。C恒溫攪拌，定時取樣lmL生理鹽水透 析液，同時補充等量的生理鹽水，依法測定樣品溶液中草烏甲素的量。并按如上方法計算釋 放百分比。
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結果普通脂質體在6小時左右藥物釋放超過90%，而多囊脂質體在第3天(72小 時)時，藥物釋放才達到90%以上，包封的草烏甲素基本釋放完全(如圖l所示)。說明本 發明草烏甲素多囊脂質體與普通脂質體相比，具有明顯的緩釋效果。
權利要求
一種草烏甲素多囊脂質體，其特征在于，包括藥物活性成分草烏甲素和空白多囊脂質體作為載體，所述的空白多囊脂質體包括下列質量份的各組分脂質成分1份和離子梯度調節劑0.1～50份，其中脂質成分中包括摩爾比為5～36∶1的兩親性脂質和中性脂質。
2. 如權利要求i所述的草烏甲素多囊脂質體，其特征在于，其中藥脂比是i : io i : ioo，ooo。
3. 如權利要求l所述的草烏甲素多囊脂質體，其特征在于，所述的空白多囊脂質體包 括下列質量份的各組分脂質成分1份和離子梯度調節劑0. 5 20份，其中脂質成分中包 括摩爾比10 20 : 1的兩親性脂質和中性脂質。
4. 如權利要求1所述的草烏甲素多囊脂質體，其特征在于，所述的兩親性脂質為選自 卵磷脂、大豆磷脂、氫化大豆磷脂、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、硬脂胺、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、 二油酰磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、腦磷脂、鞘磷脂、二棕櫚酰磷脂酰 絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸和二棕櫚酰磷脂酰甘油中的一種或幾種。
5. 如權利要求1所述的草烏甲素多囊脂質體，其特征在于，所述的中性脂質為選自三 油脂、三辛脂和大豆油中的一種或幾種。
6. 如權利要求1所述的草烏甲素多囊脂質體，其特征在于，所述的離子梯度調節劑選 自硫酸銨、硫酸銅、硫酸錳、硫酸鎂、醋酸鈣、檸檬酸和二氯化錳中的一種或幾種。
7. 如權利要求1所述的草烏甲素多囊脂質體，其特征在于，所述的脂質成份中，還進一 步包括固醇。
8. 如權利要求7所述的草烏甲素多囊脂質體，其特征在于，所述的固醇為膽固醇。
9. 如權利要求7所述的草烏甲素多囊脂質體，其特征在于，所述的固醇與脂質成分中 的中性脂質的摩爾比為0.7 65 : 1。
10. 如權利要求1所述的草烏甲素多囊脂質體，其特征在于，還包含滲透壓調節劑。
11. 如權利要求io所述的草烏甲素多囊脂質體，其特征在于，滲透壓調節劑的含量為0. 08 15份。
12. 如權利要求IO所述的草烏甲素多囊脂質體，其特征在于，所述的滲透壓調節劑選 自葡萄糖、蔗糖、甘露醇、氯化鈉、海藻糖、琥珀酸鹽、環糊精、精氨酸、半乳糖、甘露糖、麥芽 糖、甘露糖醇、甘氨酸、賴氨酸、檸檬酸鹽、山梨醇和葡聚糖中的一種或幾種。
13. —種如權利要求1 12任一項所述草烏甲素多囊脂質體的制備方法，其特征在于， 包括以下步驟① 將脂質成份溶于有機溶劑中作為脂質相，該脂質成分包括兩親性脂質和中性脂質；② 將離子梯度調節劑溶解于水中，作為內水相，將所述內水相加入脂質相，混合乳化制 得油包水(W/0)型初乳；③ 將外水相加入所述油包水型初乳中，混合形成水包油包水(W/0/W)型復乳；④ 除去步驟③得到的復乳中的有機溶劑，制得空白多囊脂質體混懸液初品；⑤ 用等滲溶液洗滌所述空白多囊脂質體混懸液初品，再分散于等滲溶液中，制得空白 多囊脂質體成品；⑥ 將草烏甲素和滲透壓調節劑溶解于水中；⑦ 將步驟⑥所得的溶液和步驟⑤所得的空白多囊脂質體成品混合，在高于脂質的相轉變溫度孵育，制得草烏甲素多囊脂質體混懸液初品；⑧用等滲溶液洗滌所述草烏甲素多囊脂質體混懸液初品，再分散于等滲溶液中，制得 草烏甲素多囊脂質體成品。
14. 如權利要求13所述的制備方法，其特征在于，步驟①所述的有機溶劑為選自醚、 烴、鹵代烴、鹵代醚和酯中的一種或幾種。
15. 如權利要求13所述的制備方法，其特征在于，步驟①所述的脂質相中，兩親性脂質 的濃度為5 120mM，兩親性脂質和中性脂質的摩爾比為5 36 : 1。
16. 如權利要求13所述的制備方法，其特征在于，步驟②所述的離子梯度調節劑在內 水相中的濃度為10 1000mM。
17. 如權利要求13所述的制備方法，其特征在于，步驟②所述的內水相中還加入滲透 壓調節劑，然后才將所述內水相加入脂質相，混合乳化制得油包水(W/0)型初乳。
18. 如權利要求13所述的制備方法，其特征在于，步驟②所述的內水相和脂質相的體積比為i : i i : 4。
19. 如權利要求13所述的制備方法，其特征在于，步驟③所述的外水相中包含輔助乳 化劑和滲透壓調節劑，輔助乳化劑選自賴氨酸、甘氨酸和組氨酸中的一種或幾種。
20. 如權利要求19所述的制備方法，其特征在于，所述的外水相中的輔助乳化劑濃度 為20 80mM。
21. 如權利要求13所述的制備方法，其特征在于，步驟③所述的油包水型初乳和外水 相的體積比為1 : 2. 5 1 : 10。
22. 如權利要求13所述的制備方法，其特征在于，步驟⑤和步驟⑧所述的等滲溶液為 生理鹽水。
23. 如權利要求13所述的制備方法，其特征在于，步驟⑥中所述的草烏甲素的濃度為 0. 1 200ug/ml。
全文摘要
本發明公開了一種草烏甲素多囊脂質體及其制備方法。該草烏甲素多囊脂質體，包括藥物活性成分草烏甲素和空白多囊脂質體作為載體，所述的空白多囊脂質體包括下列質量份的各組分脂質成分1份和離子梯度調節劑0.1～50份，其中脂質成分中包括摩爾比為5～36∶1的兩親性脂質和中性脂質。本發明采用包封有梯度調節劑的空白多囊脂質體，通過跨膜梯度主動載藥法將草烏甲素透過磷脂膜進入空白多囊脂質體內水相，得到了草烏甲素的多囊脂質體。本發明原料利用率高，載藥濃度高，在體內、體外試驗中均顯示有良好的緩釋作用，具有更佳的抗腫瘤效果。
文檔編號A61K31/439GK101744765SQ20081020464
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月16日 優先權日2008年12月16日
發明者李軍, 楊耀杰, 王莉莉, 虞麗芳, 陸偉根, 陳亭亭 申請人:上海醫藥工業研究院