一種草烏甲素的高效提取分離方法
【專利摘要】一種草烏甲素的高效提取分離方法，包括前處理、浸提、濃縮、酸化、堿化、萃取、柱層析、結晶步驟。該方法用含硫酸3‰的酸性75％乙醇溶液提取三次，堿化在攪拌下緩緩加入濃氨水調pH至8，降低了草烏甲素的損耗；硅膠柱層析，合理有效控制柱層析流速為13～20ml/min，分離效果更佳；用乙酸乙酯萃取，可使溶劑殘留物為零，草烏甲素含量最高可達到98～99％，產品純度高，在草烏藥材中草烏甲素的提取率可提高到1.5～2.2‰。本發明方法應用無毒或低毒的有機溶劑和減少有機溶劑種類及使用量，降耗節能，減少了人員危害和環境污染。
【專利說明】一種草烏甲素的高效提取分離方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物有效成分提取分離純化【技術領域】，具體涉及一種從草烏原料藥材中提取分離草烏甲素的產業化技術。
【背景技術】
[0002]近年來從滇西民間用于鎮痛抗炎的草藥滇西烏頭中分離所得的生物堿草烏甲素(Bulleyaconitine A)，又稱滇西嘟啦堿甲，是優良的鎮痛抗炎類藥物，其鎮痛作用比烏頭堿強，免疫調節作用比烏頭堿弱。它同時具有中樞鎮痛和外周鎮痛雙重藥理作用。草烏甲素適用于治療癌癥晚期疼痛、風濕性及類風濕性關節炎、肩周炎、肩臂痛、落枕、骨關節炎、良性關節痛、腰及四肢關節扭傷、挫傷、腰肌勞損及腰背痛、坐骨神經痛、肌纖維炎及肋軟骨炎、帶狀皰疹、感冒頭痛等。目前已開發出草烏甲素片、膠囊、口服液、注射劑等劑型新藥，臨床主要用于治療多種急、慢性疼痛，如風濕及類風濕性關節炎、骨關節炎、肩周炎和良性關節痛、腰及四肢關節扭傷、牙痛及帶狀皰疹的止痛等。
[0003]《中國藥典》2010年版二部草烏甲素分子式C35H49NOltl,分子量643.77，為白色結晶或結晶性粉末。在乙醇、三氯甲烷或乙醚中易溶，在水中不溶；在稀鹽酸或稀硫酸中極易溶解。
[0004]傳統方法有利用氨水堿化，苯提取、氯仿萃取，氧化鋁柱層析，乙醚-苯洗脫的方法分離草烏甲素；還有利用堿水浸泡，汽油或石油醚回流提取，再用汽油、乙酸乙酯、三乙胺混合溶劑為洗脫劑進行柱層析。另有用酸水等溶劑提取，調PH值，乙酸乙酯或氯仿萃取，再用汽油、石油醚、丙酮和二乙胺等溶劑為洗脫劑進行柱層析。因其使用高毒性的有機溶劑苯和氯仿及大量的使用易燃易爆的有機溶劑，給生產人員帶來不安全因素，且成本高，同時也不可避免的造成了環境污染。
【發明內容】
[0005]本發明根據實際生產，針對現有技術的不足之處，研究提供一種低耗環保的草烏甲素的高效提取分離方法。本發明通過提取方法、提取溶劑的改進，應用無毒或低毒的有機溶劑和減少有機溶劑種類及使用量，以達到降耗節能，減少人員危害和環境污染，及能得到收率高、純度高的草烏甲素目的。
[0006]本發明所提供的一種草烏甲素的高效提取分離方法，包括以下步驟:
[0007](I)前處理:取草烏藥材，去除雜質，粉碎成粗粉；
[0008](2)浸提、濃縮:取草烏藥材粗粉，置圓底燒瓶中，加入含硫酸3%。的酸性75%乙醇溶液提取三次，第一次提取:在草烏藥材粗粉中加入為草烏藥材粗粉重量3.2倍重量的所述含硫酸3%。的酸性75%乙醇溶液，控制蒸汽壓力0.1MPa，加熱至60°C保溫浸提12小時，過濾，收集濾液；第二、三次采用與第一次同樣的方法分別在每次的濾渣中加入為濾渣重量2.4倍重量的所述含硫酸3%。的酸性75%乙醇溶液，分別提取2?4小時，過濾，收集濾液，合并三次提取液濾，在0.02?0.04MPa真空濃縮回收至無醇味，濃縮液加入為濃縮液重量1.5倍重量純化水稀釋至相對密度為1.05?1.07 ;
[0009](3)酸化、堿化:在步驟(2)稀釋至相對密度為1.05?1.07的稀釋液中加入10%稀硫酸調PH至2，靜置24小時，過濾，濾液在攪拌下緩緩加入濃氨水調pH至8，靜置24小時,過濾,濾液備用；
[0010](4)萃取:將步驟(3)堿化的濾液注入分液漏斗，加入為所述堿化的濾液體積1.6?2倍體積的乙酸乙酯，攪拌萃取30min?45min，靜置2?3小時，分離上層乙酸乙酯萃取液，下層水液按上述萃取方法操作，重復萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液；將合并的乙酸乙酯萃取液在0.02?0.04MPa真空濃縮，控制溫度在60°C ±5°C，濃縮回收乙酸乙酯至稠膏狀，收集稠膏，在稠膏中加入為所述稠膏重量10倍重量純化水充分攪勻，攪拌下加入濃度為10%的稀硫酸溶液調pH至2使稠膏完全溶解，靜置12小時，過濾，濾液在攪拌下緩緩加入濃氨水調pH至8.5?9，使沉淀完全，靜置12小時，過濾，沉淀用純化水洗至pH呈中性，收集沉淀，即得草烏總堿；草烏總堿用乙酸乙酯溶解后，加入為草烏總堿重量0.6?1.2倍重量硅膠混合均勻，干燥控制水分< 15%，裝入潔凈容器中，密封；
[0011](5)柱層析:娃膠柱層析,用石油醚:乙酸乙酯:三乙胺的體積比=4:1:0.075的溶劑系統進行洗脫，控制流速13?20ml/min，通過薄層色譜檢識觀察洗脫情況，分段收集含草烏甲素的洗脫液，合并所述洗脫液；
[0012](6)結晶:用旋轉蒸發儀0.02?0.04MPa真空濃縮合并的洗脫液，溫度600C ±5°C，即得草烏甲素粗品結晶；將草烏甲素粗品置圓底燒瓶中，加入為草烏甲素粗品重量4倍重量的乙酸乙酯使草烏甲素粗品充分溶解，在0.02?0.04MPa真空濃縮至1/3體積，用石油醚邊加邊振搖至晶體析出，靜置使結晶完全，過濾，再用石油醚洗滌結晶至顏色成均一的白色結晶，干燥，即為草烏甲素純品；
[0013]以上各步驟中所述的百分數為質量分數，所述的千分數為質量分數。
[0014]本發明與現有技術相比具有如下創新點:
[0015]1、由以前的溫浸改為減壓熱回流提取，主要成分草烏甲素不易破壞，收率高，草烏藥材中草烏甲素的提取率可提高到1.5?2.2%0。
[0016]2、堿化過程，之前的工藝直接加堿，導致草烏甲素在堿化過程中被分解，現在采取將堿液緩緩加入，并進行攪拌，調pH值至8，降低了草烏甲素的損耗；
[0017]3、萃取:原工藝溶劑采用苯、三氯甲烷，由于該溶劑為高毒性，給生產人員帶來不安全因素，且成本高。通過有機溶劑對比選擇，采用乙酸乙酯進行萃取，使得溶劑殘留物為零，草烏甲素成品檢驗合格率聞。
[0018]4、合理有效控制柱層析流速，分離效果更佳，草烏甲素含量最高可達到98?99 %，高于國家藥典標準含量97 %。
[0019]綜上所述，本發明方法降低了草烏甲素的損耗，合理有效控制柱層析流速為13?20ml/min,分離效果更佳；用乙酸乙酯萃取，可使溶劑殘留物為零，草烏甲素含量最高可達到98?99%，產品純度高，在草烏藥材中草烏甲素的提取率可提高到1.5?2.2%。，達到了高效提取分離的效果，適宜產業化生產。本發明方法應用無毒或低毒的有機溶劑和減少有機溶劑種類及使用量，同時達到了降耗節能，減少人員危害和環境污染的效果。
【具體實施方式】
[0020]以下各實施例無特殊說明的為常規方法。
[0021]實施例1
[0022](I)前處理:取草烏塊根500g，揀選，去除雜質，粉碎成粗粉。
[0023](2)浸提、濃縮:取草烏藥材粗粉，置圓底燒瓶中，加入含硫酸3%。質量分數的酸性75%乙醇溶液提取三次，第一次提取:在草烏藥材粗粉中加入為草烏藥材粗粉重量3.2倍重量的所述含硫酸3%。的酸性75%乙醇溶液，控制蒸汽壓力0.1MPa，加熱至60°C保溫浸提12小時，過濾，收集濾液；第二、三次采用與第一次同樣的方法分別在每次的濾渣中加入為濾渣重量2.4倍重量的所述含硫酸3%。的酸性75%乙醇溶液，分別提取2小時(第二次提取2小時)、提取4小時(第二次提取4小時)，過濾，收集濾液，合并三次提取液濾，合并的提取液濾在0.02MPa真空濃縮回收至無醇味，濃縮液加入為濃縮液重量1.5倍重量純化水稀釋至相對密度為1.05。
[0024](3)酸化、堿化:在步驟(2)稀釋至相對密度為1.05的稀釋液中加入10%稀硫酸調pH至2，靜置24小時，過濾，在濾液中緩緩加入濃氨水同時攪拌調pH至8，靜置24小時，過濾，濾液備用。
[0025](4)萃取:將步驟(3)堿化的濾液注入分液漏斗，加入為所述堿化的濾液體積1.6?2倍體積的乙酸乙酯，攪拌萃取30min，靜置2小時，分離上層乙酸乙酯萃取液，下層水液按上述萃取方法操作，重復萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液；將合并的乙酸乙酯萃取液在0.02MPa真空濃縮，控制溫度在55°C，濃縮回收乙酸乙酯至稠膏狀，收集稠膏，裝入潔凈容器中，稱重，在稠膏中加入為所述稠膏重量10倍重量純化水充分攪勻，攪拌下加入濃度為10%的稀硫酸溶液調pH至2使稠膏完全溶解，靜置12小時，過濾，濾液在攪拌下緩緩加入濃氨水調pH至8.5?9，使沉淀完全，靜置12小時，過濾，沉淀用純化水洗至pH呈中性，收集沉淀，即得草烏總堿；草烏總堿用適量乙酸乙酯溶解后，加入為草烏總堿重量0.6倍重量硅膠混合均勻，干燥控制水分< 15 %，裝入潔凈容器中，密封。
[0026](5)柱層析:娃膠柱層析，用石油醚:乙酸乙酯:三乙胺的體積比=4:1:0.075的溶劑系統進行洗脫，控制流速13ml/min，通過薄層色譜檢識觀察洗脫情況，分段收集含草烏甲素的洗脫液，合并所述洗脫液。
[0027](6)結晶:用旋轉蒸發儀0.02MPa真空濃縮合并的洗脫液，溫度55°C，即得草烏甲素粗品結晶；將草烏甲素粗品置圓底燒瓶中，加入為草烏甲素粗品重量4倍重量的乙酸乙酯使草烏甲素粗品充分溶解，在0.02MPa真空濃縮至1/3體積，用石油醚邊加邊振搖至晶體析出，靜置使結晶完全，過濾，再用石油醚洗滌結晶至顏色成均一的白色結晶，干燥稱重，即為草烏甲素純品。草烏甲素的收率為43.36% (按草烏總堿量計算)，經高效液相色譜法檢測其草烏甲素純品中含量草烏甲素為97.78%。以上各步驟中所述的百分數為質量分數，所述的千分數為質量分數。
[0028]實施例2
[0029]實施例2除以下步驟操作不同外，其余步驟的各操作與實施例1相同，不再贅述。
[0030](2)浸提、濃縮:合并的提取液濾在0.04MPa真空濃縮回收至無醇味，濃縮液加入為濃縮液重量1.5倍重量純化水稀釋至相對密度為1.07。
[0031](4)萃取:將步驟(3)堿化的濾液注入分液漏斗，加入為所述堿化的濾液體積2倍體積的乙酸乙酯，攪拌萃取45min，靜置3小時。
[0032]將合并的乙酸乙酯萃取液在0.04MPa真空濃縮，控制溫度在65°C，濃縮回收乙酸乙酯至稠膏狀，收集稠膏，裝入潔凈容器中，稱重。
[0033]所得的草烏總堿用適量乙酸乙酯溶解后，加入為草烏總堿重量1.2倍重量硅膠混合均勻，干燥控制水分< 15 %，裝入潔凈容器中,密封。
[0034](5)柱層析:娃膠柱層析控制流速20ml/min。
[0035](6)結晶:用旋轉蒸發儀0.04MPa真空濃縮合并的洗脫液，溫度65°C，即得草烏甲素粗品結晶；將草烏甲素粗品置圓底燒瓶中，加入為草烏甲素粗品重量4倍重量的乙酸乙酯使草烏甲素粗品充分溶解，在0.04MPa真空濃縮至1/3體積。所得草烏甲素的收率為43.36% (按草烏總堿量計算)，按實施例1相同的方法檢測，其草烏甲素純品中草烏甲素含量為 98.77%。
【權利要求】
1.一種草烏甲素的高效提取分離方法，包括以下步驟: (1)前處理:取草烏藥材，去除雜質，粉碎成粗粉； (2)浸提、濃縮:取草烏藥材粗粉，置圓底燒瓶中，加入含硫酸3%。的酸性75%乙醇溶液提取三次，第一次提取:在草烏藥材粗粉中加入為草烏藥材粗粉重量3.2倍重量的所述含硫酸3%。的酸性75%乙醇溶液，控制蒸汽壓力0.1MPa，加熱至60°C保溫浸提12小時，過濾，收集濾液；第二、三次采用與第一次同樣的方法分別在每次的濾渣中加入為濾渣重量2.4倍重量的所述含硫酸3%。的酸性75%乙醇溶液，分別提取2?4小時，過濾，收集濾液，合并三次提取液濾，在0.02?0.04MPa真空濃縮回收至無醇味，濃縮液加入為濃縮液重量1.5倍重量純化水稀釋至相對密度為1.05?1.07 ; (3)酸化、堿化:在步驟⑵稀釋至相對密度為1.05?1.07的稀釋液中加入10%稀硫酸調PH至2，靜置24小時，過濾，濾液在攪拌下緩緩加入濃氨水調pH至8，靜置24小時，過濾，濾液備用； (4)萃取:將步驟(3)堿化的濾液注入分液漏斗,加入為所述堿化的濾液體積1.6?2倍體積的乙酸乙酯，攪拌萃取30min?45min，靜置2?3小時，分離上層乙酸乙酯萃取液，下層水液按上述萃取方法操作，重復萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液；將合并的乙酸乙酯萃取液在0.02?0.04MPa真空濃縮，控制溫度在60°C ±5°C，濃縮回收乙酸乙酯至稠膏狀，收集稠膏，在稠膏中加入為所述稠膏重量10倍重量純化水充分攪勻，攪拌下加入濃度為10%的稀硫酸溶液調PH至2使稠膏完全溶解，靜置12小時，過濾，濾液在攪拌下緩緩加入濃氨水調pH至8.5?9，使沉淀完全，靜置12小時，過濾，沉淀用純化水洗至pH呈中性，收集沉淀，即得草烏總堿；草烏總堿用乙酸乙酯溶解后，加入為草烏總堿重量0.6?1.2倍重量硅膠混合均勻，干燥控制水分< 15%，裝入潔凈容器中，密封； (5)柱層析:硅膠柱層析，用石油醚:乙酸乙酯:三乙胺的體積比=4:1:0.075的溶劑系統進行洗脫，控制流速13?20ml/min，通過薄層色譜檢識觀察洗脫情況，分段收集含草烏甲素的洗脫液，合并所述洗脫液； (6)結晶:用旋轉蒸發儀0.02?0.04MPa真空濃縮合并的洗脫液，溫度60°C ±5°C，SP得草烏甲素粗品結晶；將草烏甲素粗品置圓底燒瓶中，加入為草烏甲素粗品重量4倍重量的乙酸乙酯使草烏甲素粗品充分溶解，在0.02?0.04MPa真空濃縮至1/3體積，用石油醚邊加邊振搖至晶體析出，靜置使結晶完全，過濾，再用石油醚洗滌結晶至顏色成均一的白色結晶，干燥，即為草烏甲素純品； 以上步驟中所述的百分數為質量分數，所述的千分數為質量分數。
【文檔編號】C07D221/22GK104326981SQ201410548962
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月16日 優先權日:2014年10月16日
【發明者】姜學鋒, 丁燕龍, 楊福榮, 武逵, 唐合柱 申請人:云南大圍山生物制藥有限公司