專利名稱：一種抗草甘膦棉花的快速鑒定方法
技術領域：
本發明涉及植物保護技術領域，具體地說，涉及除草劑生物測定技術，更具體地說，涉及一種抗草甘膦棉花的快速鑒定方法。
背景技術：
棉花是我國重要的經濟作物，常年種植面積500萬hm2，占經濟作物總面積的26%，是國民經濟的重要支柱產業。然而，我國棉田雜草危害較重，常年造成損失在14% 16%，嚴重制約了棉花的優質、高效生產。草甘膦作為一種廣譜內吸滅生性除草劑，在棉田雜草的防除中發揮著重要的作用。但是，由于草甘膦不具有在雜草和棉花之間的選擇性，在使用草甘膦時，往往容易對常規棉花品種造成藥害，甚至死亡。轉基因抗草甘膦棉花的應用不僅可以避免藥害的產生，還可以擴大草甘膦的使用范圍和靈活性。自1997年美國率先開始種植轉基因抗草甘膦棉花以來，抗草甘膦棉花在美國的種植面積占棉花總種植面積的比例從1997年的3.2%增加到2009年的70%左右。目前，我國正在實施轉基因抗草甘膦棉花新品種培育計劃，并且已經分離和鑒定了多個擁有自主知識產權的草甘膦高抗基因，并已經獲得一批穩定表達的單抗草甘膦和具有抗草甘膦抗蟲復合性狀的轉基因棉花新材料。隨著農業現代化水平的提高，農村勞動力大量城市化轉移，棉花生產對抗草甘膦品種的需求越來越強烈。轉基因抗草甘膦棉花勢必將成為我國繼抗蟲棉之后有望推廣的另一類轉基因棉花產業化品種。在抗草甘膦棉花品種選育過程中，對棉花材料進行草甘膦抗性評價不僅是棉花育種和產業化推廣的基礎，也是進行轉基因棉花環境安全性評價的內容之一，因此，研究一種抗草甘膦棉花的檢測和鑒定方法就顯得尤為重要。目前，抗草甘膦棉花的鑒定方法主要為田間或溫室植株抗性鑒定法，即在田間或溫室種植待測棉花，當棉花 長到一定葉齡后噴施一定濃度的草甘膦，根據施藥后棉花植株的死亡程度對其是否為抗草甘膦棉花做出判斷。此方法直觀準確，但是耗時長、占用空間大、季節性強。分子和蛋白測定也是一種鑒定轉基因抗草甘膦棉花的方法，但由于分子檢測所需儀器和試劑昂貴，對檢測人員的專業技術要求較高，多數公司和科研院所很難開展，另夕卜，目前國內抗草甘膦棉花尚未商業化，外源基因尚未公布，分子檢測方法受到限制。因此，建立一種快速、簡便、低成本且準確有效的抗草甘膦棉花鑒定方法對于今后抗草甘膦棉花的推廣和檢測具有重要意義。
發明內容
本發明公開了一種抗草甘膦棉花的快速鑒定方法，包括:將已露白的待測棉花種子用草甘膦溶液浸泡；清水沖洗后，將所浸泡過的種子置于光照培養箱中進行砂培；統計出苗數，計算出苗率；根據出苗率判斷待測棉花是否為抗草甘膦棉花，其中出苗率大于或等于70%的為抗草甘膦棉花，而出苗率小于或等于30%的為非抗草甘膦棉花。在上述抗草甘膦棉花的快速鑒定方法中，在所述浸泡的步驟中，可將部分已露白的待測棉花種子用草甘膦溶液浸泡，可將另一部分已露白的待測棉花種子用清水浸泡，其中清水浸泡的種子為對照；在所述統計和計算的步驟中，可統計出苗數和胚根長，可計算出苗率和胚根生長抑制率；在所述判斷的步驟中，可根據出苗率和胚根生長抑制率判斷待測棉花是否為抗草甘膦棉花，其中出苗率大于或等于70%、胚根生長抑制率小于或等于30%的為抗草甘膦棉花，而出苗率小于或等于30%、胚根生長抑制率大于或等于70%的為非抗草甘膦棉花。在上述抗草甘膦棉花的快速鑒定方法中，在所述統計和計算的步驟中，還可觀察胚根生長情況；在所述判斷的步驟中，還可根據胚根生長情況判斷待測棉花是否為抗草甘膦棉花，其中胚根生長正常的為抗草甘膦棉花，而胚根生長受抑制、無側根的為非抗草甘膦棉花。在上述抗草甘膦棉花的快速鑒定方法中，其中如果清水浸泡的種子的出苗率大于或等于70%，則鑒定有效；如果清水浸泡的種子的出苗率小于70%，則鑒定無效。在上述抗草甘膦棉花的快速鑒定方法中，在所述浸泡的步驟中，所述的浸泡可包括用4.1 8.2ga.1./L的草甘膦溶液浸泡I 2小時，優選用8.2ga.1./L的草甘膦溶液浸泡I小時。在上述抗草甘膦棉花的快速鑒定方法中，所述已露白的待測棉花種子可以是通過催芽處理得到的，其中，所述的催芽處理可包括:取待測棉花種子于25 V 30°C清水中浸泡24 48小時，期間換水(Tl次。在上述抗草甘膦棉花的快速鑒定方法中，在所述砂培的步驟中，所述的砂培可包括:將滅菌的細砂和水混勻，裝入發芽盒中，將所述浸泡的步驟中浸泡過的種子均勻擺放于發芽盒中，然后在種子上覆蓋松散砂，蓋上蓋子后置于光照培養箱中培養，其中優選發芽盒的尺寸為13cm*19cm*12cm ;優選將滅菌的細砂和水按照重量比50:8 10的比例混勻，最優選按照重量比50:8的比例混 勻；其中優選在種子上覆蓋的松散砂厚1.5 2cm ;其中，所述砂培的時間優選為7天。在上述抗草甘膦棉花的快速鑒定方法中，所述光照培養箱的設定條件可為:溫度28 30°C，濕度60% 80%，光照與黑暗比為8 14小時:16 10小時，優選為8小時:16小時，光照強度6000 80001x。在上述抗草甘膦棉花的快速鑒定方法中，所述的細砂滅菌方法可包括:將細砂過篩后置于干燥箱中高溫滅菌，優選在120 180°C下干熱滅菌4 6小時。在上述抗草甘膦棉花的快速鑒定方法中，所述的草甘膦優選為農達(Roundup),其含有41%草甘膦異丙胺鹽，由美國孟山都公司生產。應用本申請的鑒定方法對抗草甘膦棉花進行鑒定，具有以下優點:(I)周期短，一般8天左右即可獲得鑒定結果。與田間或溫室抗性鑒定方法相比，鑒定周期縮短了 35天左右。(2)工作量小。本申請的鑒定方法在室內完成，無需進行整地、播種、施藥等操作，一人便可完成整個鑒定過程。并且占用空間小，可以同時對多個材料進行鑒定。(3)不受季節限制。本申請的鑒定方法在室內操作，種子在光照培養箱中培養。與田間或溫室抗性鑒定方法相比，本申請的鑒定方法避免了不良氣候的影響。因此，本申請的鑒定方法可以重復進行，結果一致性較好。
具體實施例方式下面將以實施例的方式對本發明作進一步的詳細描述，以使本領域技術人員能夠實踐本發明。應當理解，可以采用其他實施方式，并且可以做出適當的改變而不偏離本發明的精神或范圍。為了避免對于使本領域技術人員能夠實踐本發明來說不必要的細節，說明書可能省略了對于本領域技術人員來說已知的某些信息。因此，以下詳細描述不應以限制性的意義來理解，且本發明的范圍僅由所附權利要求界定。以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不用來限制本發明的范圍。下述實施例中所使用的各原料，除特別指出的以外，均可由市售獲得。下述實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。ga.1.的含義為有效成分含量。實施例材料與方法材料:試驗的抗草甘膦棉花材料共8種，分別為KCM1、KCM2、KCM3、KCM4、KCM5、KCM6、KCM7、KCM8 ;非抗草甘膦棉花材料共7種，分別為中棉所41、中棉所43、中棉所49、中棉所52、中棉所63、中棉所69、中棉所79,上述材料均由中國農業科學院棉花研究所育種室提供。使用的草甘膦為 農達(Roundup)，其含有41%草甘膦異丙胺鹽，由美國孟山都公司生產。方法:催芽將所有棉花種子進行硫酸脫絨，光子處理備用。取每種待測材料的種子于清水中浸泡24小時，取已露白的種子備用。浸泡每個待測樣本挑選已催芽露白的、飽滿的棉花種子，用草甘膦溶液浸泡，隨后用水沖洗。同時，設清水對照處理:用清水浸泡待測樣本。砂培將細砂過篩后置于干燥箱中180°C下干熱滅菌4小時，晾涼后將細砂和水按照重量比50kg:8kg的比例混勻，裝入尺寸為13cm*19cm*12cm的發芽盒中，至2/3高度。將以上處理過的棉花種子均勻擺放于發芽盒中，每盒30粒種子，重復3次。然后在種子上覆蓋約1.5cm的松散砂,蓋上蓋子后置于光照培養箱中培養。光照培養箱的設定條件為,溫度30。。，濕度60% 80%，光照與黑暗比為8小時:16小時，光照強度60001x。統計和計算砂培7天后，統計清水處理和草甘膦處理的棉花種子的出苗數，計算出苗率，統計胚根長，并計算胚根生長抑制率。其中種子出苗的判斷標準為子葉破土。胚根生長抑制率％的計算公式是:胚根生長抑制率%=(清水對照組的胚根長-草甘膦處理組的胚根長)X 100/清水對照組的胚根長實施例1
抗草甘膦棉花材料(1^11、1^12、1^10)和非抗草甘膦棉花材料(中棉所49、中棉所79)，分別用濃度為4.lga.1./L、6.15ga.1./L和8.2ga.1./L的草甘膦溶液浸泡I小時和2小時，實驗結果列于表I。表I經草甘膦不同濃度不同時間處理后待測棉花種子的出苗率和胚根生長抑制
率
權利要求
1.一種抗草甘膦棉花的快速鑒定方法，包括: 將已露白的待測棉花種子用草甘膦溶液浸泡； 清水沖洗后，將所浸泡過的種子置于光照培養箱中進行砂培； 統計出苗數，計算出苗率； 根據出苗率判斷待測棉花是否為抗草甘膦棉花，其中出苗率大于或等于70%的為抗草甘膦棉花，而出苗率小于或等于30%的為非抗草甘膦棉花。
2.按權利要求1所述的方法，其中， 在所述浸泡的步驟中，將部分已露白的待測棉花種子用草甘膦溶液浸泡，將另一部分已露白的待測棉花種子用清水浸泡，其中清水浸泡的種子為對照； 在所述統計和計算的步驟中，統計出苗數和胚根長，計算出苗率和胚根生長抑制率； 在所述判斷的步驟中，根據出苗率和胚根生長抑制率判斷待測棉花是否為抗草甘膦棉花，其中出苗率大于或等于70%、胚根生長抑制率小于或等于30%的為抗草甘膦棉花，而出苗率小于或等于30%、胚根生長抑制率大于或等于70%的為非抗草甘膦棉花。
3.按權利要求1或2所述的方法，其中， 在所述統計和計算的 步驟中，還觀察胚根生長情況； 在所述判斷的步驟中，還根據胚根生長情況判斷待測棉花是否為抗草甘膦棉花，其中胚根生長正常的為抗草甘膦棉花，而胚根生長受抑制、無側根的為非抗草甘膦棉花。
4.按權利要求2所述的方法，其中如果清水浸泡的種子的出苗率大于或等于70%，則鑒定有效；如果清水浸泡的種子的出苗率小于70%，則鑒定無效。
5.按權利要求1或2所述的方法，其中，在所述浸泡的步驟中，所述的浸泡包括用4.1 8.2g a.1./L的草甘膦溶液浸泡I 2小時，優選用8.2ga.1./L的草甘膦溶液浸泡I小時。
6.按權利要求1或2所述的方法，其中，所述已露白的待測棉花種子是通過催芽處理得到的，其中，所述的催芽處理包括:取待測棉花種子于25°C 30°C清水中浸泡24 48小時，期間換水(Tl次。
7.按權利要求1或2所述的方法，其中，在所述砂培的步驟中，所述的砂培包括:將滅菌的細砂和水混勻，裝入發芽盒中，將所述浸泡的步驟中浸泡過的種子均勻擺放于發芽盒中，然后在種子上覆蓋松散砂，蓋上蓋子后置于光照培養箱中培養，其中優選發芽盒的尺寸為13cm*19cm*12cm ;優選將滅菌的細砂和水按照重量比50:8 10的比例混勻，最優選按照重量比50:8的比例混勻；其中優選在種子上覆蓋的松散砂厚1.5 2cm ;其中，所述砂培的時間優選為7天。
8.按權利要求1或2所述的方法，其中，所述光照培養箱的設定條件為:溫度28 30°C，濕度60% 80%，光照與黑暗比為8 14小時:16 10小時，優選為8小時:16小時，光照強度6000 80001x。
9.按權利要求7所述的方法，其中，所述的細砂滅菌方法包括:將細砂過篩后置于干燥箱中高溫滅菌，優選在120 180°C下干熱滅菌4 6小時。
10.按權利要求1或2所述的方法，其中，所述的草甘膦為農達，其含有41%草甘膦異丙胺鹽。
全文摘要
一種抗草甘膦棉花的快速鑒定方法，包括將已露白的待測棉花種子用草甘膦溶液浸泡；清水沖洗后，將所浸泡過的種子置于光照培養箱中進行砂培；統計出苗數，計算出苗率；根據出苗率判斷待測棉花是否為抗草甘膦棉花。本發明的鑒定方法，克服了田間或溫室鑒定周期長、工作量大、易受季節限制等缺點，具有很強的實用性和可操作性。
文檔編號A01G7/00GK103081731SQ20131006502
公開日2013年5月8日 申請日期2013年2月28日 優先權日2013年2月28日
發明者馬艷, 馬小艷, 崔金杰, 姜偉麗, 雒珺瑜, 馬亞杰, 奚建平, 李希風 申請人:中國農業科學院棉花研究所