專利名稱：一種創造草地早熟禾抗草甘膦新種質的方法
技術領域：
本發明涉及植物組織培養方法技術領域，是一種創造草地早熟禾種質的方法。
背景技術：
草地早熟禾被稱為“草坪草之王”，原產歐洲、亞洲北部及非洲北部，后引到北美洲，現遍及全球溫帶地區。草地早熟禾屬多年生草本植物，須根系，具有根狀莖，繁殖迅速，再生力強，耐修剪。葉色誘人，質地細軟，顏色光亮鮮綠，綠期長，具有較好的耐踐踏性，廣泛利用于家庭、公園、醫院、學校等公共綠地、觀賞性草坪以及高爾夫球場、運動場草坪，還可應用于堤壩護坡等設施草坪。
雜草是草坪的大敵。尤其是稗草、馬唐、藜、莧、空心蓮子草、打碗花、牛筋草、一年篷、馬齒莧等危害十分嚴重的惡性雜草，防除不及時就會影響草坪的生長并降低草坪的觀賞性，嚴重者使整個草坪荒廢。因此，能否有效地防除雜草就成為草坪建植成敗的關鍵之一。目前，我國大多采用人工方式防除雜草。這不僅花費成本高、效率低，而且防除不容易徹底，并且在剔除雜草的過程中常會造成草坪的機械損傷。應用除草劑除草不僅除草效率高、防除徹底，而且大大減輕了勞動強度并降低了除草成本，據有關的報告調查，化學除草所花費用為人工除草的1/30到1/20。因此，隨著草坪種植面積的不斷擴大，雜草的化學防除已成為提高草坪經濟效益、觀賞效益和社會效益的重要技術措施之一。
除草劑的種類很多，根據其防除對象分，可以分為廣譜性和選擇性除草劑。使用廣譜性除草劑效率高，但因其殺傷面太大而在草坪管理上常局限用于草坪建坪前的除草。而目前常用的選擇性除草劑盡管對雜草防除有一定的選擇性，但這種選擇性常會因草坪草與雜草的組合不同，除草劑使用的濃度不同而對草坪草造成傷害。因此限制了除草劑在草坪管理上的應用。草甘膦是一種廣譜性除草劑，通過體細胞無性系變異篩選，獲得新型的抗草甘膦草坪草，將對于除草劑在草坪管理上的推廣應用起到很大的促進作用。
發明內容
本發明要解決的技術問題是公開一種通過體細胞無性系變異篩選創造草地早熟禾抗草甘膦新種質的方法。
本發明解決技術問題的方案是取草地早熟禾的幼嫩花序切段為外植體，在誘導培養基上誘導愈傷組織發生，然后對愈傷組織進行繼代培養增殖，選取已分化出綠點的愈傷組織，在附加草甘膦的篩選培養基上篩選，對篩選存活的愈傷組織進行恢復培養和擴增，然后轉入分化培養基上分化成苗，小苗生根長大后移栽，檢測其抗草甘膦的效能。
具體由以下步驟完成1、取草坪或溫室盆栽生長1～3個月的早熟禾植株主莖，用70～75％乙醇棉球擦拭外層包葉2～4遍后，在無菌工作臺上剝去1～3層外包葉，剩余部分切成8～12cm的切段，置于0.05％～0.1％的氯化汞溶液中，浸泡4～10分鐘消毒，然后用無菌水沖洗3～5次，放在無菌濾紙上吸干切段表面水分，接種在MS0培養基上，放在溫度為24±2℃的培養室，黑暗條件下培養。
2、培養在MS0培養基上的早熟禾主莖切段，2～5周后一部分即有幼穗伸出包葉，將這些幼穗切成2～4cm的切段，接種于誘導培養基(MS+2，4-D 2～5mg/L+蔗糖2％～6％+瓊脂0.6％～0.8％，pH5.6～6.5)上誘導愈傷組織，培養條件同上。3～8周可獲得愈傷組織，誘導率為70％～100％。
3、取誘導出的鮮黃、松脆、顆粒狀的愈傷組織，用新鮮的誘導培養基繼代培養，每隔1～3周繼代一次，直到部分愈傷組織上出現綠點。培養溫度為24±2℃，光照強度1000～3000lx，每天16h光照。
4、將有綠點的愈傷組織轉移到附加100mg/L～350mg/L草甘膦的新鮮誘導培養基上篩選，3～8周后愈傷組織存活率為1％～8％。
5、將存活的愈傷組織轉移到去掉草甘膦的新鮮誘導培養基上恢復培養，每隔1～3周繼代培養一次擴增愈傷組織，連續擴增數次。
6、將擴增的愈傷組織轉移到MS0分化培養基上，2～4周即可分化出小苗，1～2周小苗生出3～5條白色根系。
7、取8～12cm高的試管苗，在培養室內去掉瓶塞，覆蓋3～5層紗布，保持紗布濕潤5～7天。然后從試管中取出小苗，洗凈根部的瓊脂，移栽到營養缽中生長。移栽成活率為80％～100％。
8、當移栽成活的小苗生長至20～30cm高時，噴灑稀釋50～200倍(原液濃度為41％)的草甘膦溶液，3～8天后一部分植株干枯死亡，存活率為20％～50％，存活的植株生長正常。
本發明方法為草地早熟禾抗除草劑育種創造了優異材料，所獲得的草地早熟禾生長狀態良好，不受草甘膦影響。
具體實施例方式獲得抗300mg/L草甘膦的草地早熟禾新材料，首先，由草坪或溫室盆栽1個月的早熟禾植株主莖，用75％乙醇棉球擦拭外層包葉4遍后，在無菌工作臺上剝離3層外包葉，將剩余部分切成10cm的切段，置于0.1％的氯化汞溶液中，浸泡6分鐘消毒，然后用無菌水沖洗3次，放在無菌濾紙上吸干切段表面水分，接種在MS0培養基上。放在溫度為24±2℃的培養室，黑暗條件下培養。將培養在MS0培養基上的早熟禾主莖切段，3周后一部分即有幼穗伸出包葉，將這些幼穗切成4cm的切段，接種于誘導培養基(MS+2，4-D 2mg/L+蔗糖3％+瓊脂0.8％，pH5.8)上誘導愈傷組織，培養條件同上。4周可獲得愈傷組織，誘導率為80％。再取誘導出的鮮黃、松脆、顆粒狀的愈傷組織，用新鮮的誘導培養基繼代培養，每隔2周繼代一次，直到部分愈傷組織上出現綠點。培養溫度為24±2℃，光照強度1000～3000lx，每天16h光照。將有綠點的愈傷組織轉移到附加300mg/L草甘膦的新鮮誘導培養基上篩選，6周后愈傷組織存活率為1.7％。將存活的愈傷組織轉移到去掉草甘膦的新鮮誘導培養基上恢復培養，每隔2周繼代培養一次擴增愈傷組織，共擴增4次。將擴增的愈傷組織轉移到MS0分化培養基上，2周即可分化出小苗，1周小苗生出3～5條白色根系。取8～12cm高的試管苗，在培養室內去掉瓶塞，覆蓋3層紗布，保持紗布濕潤5天。然后從試管中取出小苗，洗凈根部的瓊脂，移栽到營養缽中生長。移栽成活率為80％。當移栽成活的小苗生長至30cm高時，噴灑稀釋100倍(原液濃度為41％)的草甘膦溶液，7天后一部分植株干枯死亡，存活率為40％，存活的植株生長正常。
權利要求
1.一種創造草地早熟禾抗草甘膦新種質的方法，其特征由以下步驟完成，取草地早熟禾的幼嫩花序切段為外植體，在誘導培養基上誘導愈傷組織發生，然后對愈傷組織進行繼代培養增殖，選取已分化出綠點的愈傷組織，在附加草甘膦的篩選培養基上篩選，對篩選存活的愈傷組織進行恢復培養和擴增，然后轉入分化培養基上分化成苗，小苗生根長大后移栽，檢測其抗草甘膦的效能。
2.根據權利要求1所述的創造草地早熟禾抗草甘膦新種質的方法，由以下步驟完成(1)、取草坪或溫室盆栽生長1～3個月的早熟禾植株主莖，用70～75％乙醇棉球擦拭外層包葉2～4遍后，在無菌工作臺上剝去1～3層外包葉，剩余部分切成8～12cm的切段，置于0.05％～0.1％的氯化汞溶液中，浸泡4～10分鐘消毒，然后用無菌水沖洗3～5次，放在無菌濾紙上吸干切段表面水分，接種在MS0培養基上，放在溫度為24±2℃的培養室，黑暗條件下培養；(2)、培養在MS0培養基上的早熟禾主莖切段，2～5周后一部分即有幼穗伸出包葉，將這些幼穗切成2～4cm的切段，接種于誘導培養基(MS+2，4-D 2～5mg/L+蔗糖2％～6％+瓊脂0.6％～0.8％，pH5.6～6.5)上誘導愈傷組織，培養條件同步驟1，3～8周可獲得愈傷組織，誘導率為70％～100％，誘導培養基為MS+2，4-D 2～5mg/L+蔗糖2％～6％+瓊脂0.6％～0.8％，pH5.6～6.5；(3)取誘導出的鮮黃、松脆、顆粒狀的愈傷組織，用新鮮的誘導培養基繼代培養，每隔1～3周繼代一次，直到部分愈傷組織上出現綠點。培養溫度為24±2℃，光照強度1000～3000lx，每天16h光照；(4)將有綠點的愈傷組織轉移到附加100mg/L～350mg/L草甘膦的新鮮誘導培養基上篩選，3～8周后愈傷組織存活率為1％～8％。(5)將存活的愈傷組織轉移到去掉草甘膦的新鮮誘導培養基上恢復培養，每隔1～3周繼代培養一次擴增愈傷組織，連續擴增數次；(6)將擴增的愈傷組織轉移到MS0分化培養基上，2～4周即可分化出小苗，1～2周小苗生出3～5條白色根系；(7)取8～12cm高的試管苗，在培養室內去掉瓶塞，覆蓋3～5層紗布，保持紗布濕潤5～7天。然后從試管中取出小苗，洗凈根部的瓊脂，移栽到營養缽中生長。移栽成活率為80％～100％；(8)當移栽成活的小苗生長至20～30cm高時，噴灑稀釋50～200倍的草甘膦溶液，3～8天后一部分植株干枯死亡，存活率為20％～50％，存活的植株生長正常，草甘膦溶液原濃度為41％。
全文摘要
一種創造草地早熟禾抗草甘膦新種質的方法，涉及農作物組織培養方法技術領域。主要步驟包括取草地早熟禾的幼嫩花序切段為外植體，在誘導培養基上誘導愈傷組織發生，然后對愈傷組織進行繼代培養增殖；選取已分化出綠點的愈傷組織，在附加草甘膦的篩選培養基上篩選，對篩選存活的愈傷組織進行恢復培養和擴增，然后轉入分化培養基上分化成苗；小苗生根長大后移栽，檢測其抗草甘膦的效能。本發明為草地早熟禾抗除草劑育種創造了優異材料。
文檔編號A01H3/00GK1799343SQ20051011911
公開日2006年7月12日 申請日期2005年12月28日 優先權日2005年12月28日
發明者王中偉, 劉艷芝, 王玉民, 邢少辰, 董英山, 李海云 申請人:吉林省農業科學院