[0112] 從緬因州巴港的杰克遜實驗室（Jackson Laboratories (Bar Harbor，ME))獲得幾 群4至6周齡雌性C57BL/6J小鼠。通過靜脈內給予每只小鼠5mg的5-氟尿嘧啶（5FU)， 對小鼠進行處理。在5FU處理后5天，從脛骨和股骨收集骨髓（BM)細胞。通過在5ml無菌 TAC緩沖液（135mM NH4CL，17mM Tris Ph 7. 65)中溫育將紅細胞裂解。將骨髓細胞在補加 有 5 μ g/ml 重組 Tat-Myc 和 10 μ g/ml 重組 Tat-Bcl-2 的 BM 培養基（DMEM，含有 15 % FCS、 100 單位 / 毫升的 Penn/Str印、MEM NEAA(Gibco)、10mM HEPES、重組鼠 IL-3、IL-6 和 SCF) 中擴增。
[0113] 通過將293FT細胞在DlO培養基（DMEM、10% FBSUOO單位/毫升的Penn/Str印、 MEM NEAA(Gibco)、2mM L-谷氨酰胺（Gibco))中以12X 106個細胞/板的密度接種在150mm 平板中制備細胞因子。使用磷酸鈣，將細胞用30 μ g總DNA/板進行轉染，該30 μ g總DNA 由 10 μ g pcDNA3. I-SCFUO μ g pcDNA3. 1-IL3 和 10 μ g pcDNA3. 1-IL6 組成或者由 10 μ g pcDNA3. 1-TP0、10 μ g pcDNA3. 1-Flt3-L 和 10 μ g pcDNA3. I-GM-CSF 組成（Young，R. Μ·，et al. (2008). B-cell receptor signaling in the genesis and maintenance of B-cell lymphoma. Future Oncology，4, 591-4) (Young，R.M.等人，2008 年，"B 細胞淋巴瘤的起源和 維持中的B細胞受體信號轉導"，《未來腫瘤學》，第4卷，第591-4頁））。第二天，移除培養 基并用100ml DlO培養基更換。將細胞在37°C /5% C02下溫育4至5天。收集培養基，過 濾滅菌，以30ml等分試樣在-20 °C下冷凍。
[0114] 將細胞培養28天，每48小時更換BM培養基以更新Tat融合蛋白。作為對照，將 骨髓細胞在含有細胞因子和Tat-Cre的培養基中培養。圖3A和表1顯示培養28天后所得 的HSC群體的流式細胞術分析情況。FACS分析顯示Sca-1/c-kit群體（Iin-)持續富集，而 所有其他細胞類型在28天時間里下降。
[0115] 經Tat-Myc和Tat-Bcl-2處理的細胞表達高水平的c-Kit和Sca-I，并且呈現譜系 標志物陰性（表2)。
[0116] 另外，用CFSE對一部分的該細胞進行標記，證明了 HSC當在這些培養條件下維持 時活躍地增殖（圖3B)。HSC的總體擴增狀況在圖3C和表1中示出，最終在培養28天時間 里鼠 HSC擴增了 269倍。 實例5 =Tat-Mvc和Tat-Bcl-2擴增的鼠 HSC的務棺
[0117] 將遞減數目的體外擴增HSC移植到經亞致死性輻照的Rag-I /小鼠體內。如針對 NSG小鼠所描述進行向Ragl z小鼠（杰克遜實驗室）體內的移植，例外的是Ragl z小鼠在 就要經尾靜脈注射骨髓細胞之前接受350拉德的輻照。
[0118] 移植后四周，檢查小鼠是否存在成熟T細胞和B細胞。在HSC嵌合小鼠移植了 10、 100或1000個體外擴增的HSC后，在其外周血中存在成熟的表達B220/⑶19的B細胞和表 達TCB β /CD4的T細胞（圖4A、4B和表3)。
[01191 ~還在HSC嵌合小鼠的淋巴結、脾臟、胸腺和骨髓中檢測到成熟T細胞和B細胞(圖 4C) 0
[0120] 將從嵌合小鼠的脾臟獲得的成熟鼠 T細胞和B細胞用CFSE進行標記并用抗CD3 (T 細胞）或CD40和IgM(B細胞）的單克隆抗體活化。該成熟淋巴樣細胞在經它們的抗原受 體活化后能夠母細胞化并進行細胞分裂（圖4D)。另外，將從初始HSC嵌合小鼠組獲得的骨 髓細胞用于連續移植研究。表4顯示以連續方式進行了移植的Rag-I /小鼠的外周血中檢 測到的成熟T細胞和B細胞的頻率。
實例6 :用Tat-Mvc和Tat-Bcl-2擴增源自人臍帶血的HSC
[0121] 從被本地臍帶血庫廢棄的樣品獲得新鮮的臍帶血細胞。所有的人細胞均去除身份 標識，免除機構審查委員會（IRB)的監督。臍帶血包括0+、0_、A+、A-、B+、B-和AB+，它們 都表現出大約相同的擴增狀況。
[0122] 將總臍帶血體積分成20ml等分試樣并在PBS中I : 1稀釋。將經稀釋的臍帶血 (20ml)小心地覆蓋在20ml的淋巴細胞分離液（Ficoll-Paque Plus)(安瑪西亞生物科技 公司（Amersham Biosciences)目錄號17-1440-03)上。將細胞在900x重力加速度下離心 60分鐘。用玻璃吸管移取血沉棕黃層并用PBS洗滌兩次。將細胞重新懸浮在FCB培養基 (伊思考夫培養基（Gibco))中，該培養基補加有以上描述的10%人血衆、100單位/毫升的 Penn/Str印、30ml的含SCF、IL3和IL6的培養基及30ml的含TP0、FLT3-L和GM-CSF的培養 基。FCB培養基在就要添加到胎兒臍帶血（FCB)細胞之前還補加5 μ g/ml的重組Tat-Myc 和10 μ g/ml的重組Tat-Bcl-2。在擴增期間每3天更換培養基。
[0123] 該細胞因子混合物含有IL3、IL6、TPO、Flt3-L、SCF和GM-CSF，這在該六種細胞 因子的組合方面不同于先前報道的培養基（Suzuki，T.，et al. (2006). Stem Cells 24， 2456-65 (Suzuki，T.等人，2006年，《干細胞》，第24卷，第2456-65頁）），重組Tat-Myc和 Tat-Bcl-2的添加也不同。對體外擴增的人HSC的表面表型的評估表明，人HSC在Tat-Myc 和Tat-Bcl-2存在下長期培養后保持其表面特性（圖5A)。這組條件導致在培養14天中 ⑶34+細胞的數目增加86. 4倍，并且在培養21天中源自未經分級分離的臍帶血的人⑶34+ 細胞的數目增加103. 8倍（圖5B)。 實例7 =Tat-Mvc和Tat-Bcl-2擴增的人臍帶血HSC在體外和體內具有牛物活件
[0124] 將體外擴增的人HSC接種在MethoCult Optimum(干細胞技術公司（StemCell Technologies))上，檢查其產生特定的集落類型的能力。該體外擴增的人HSC能夠產生 CFU-G、CFU-M、CFU-GM 和 BFU-E 集落（圖 5C 和 。另外，雖然在 Tat-Myc 和 Tat-Bcl-2 存 在下擴增的HSC的表面表型在培養中保持，但它們的集落形成單位含量在這些條件下顯著 富集（圖OT)。在Tat-Myc和Tat-Bcl-2存在下擴增的CD34+細胞還能夠產生新的BFU-E、 CFU-M、CFU-G和CFU-GM集落，而在單獨培養基中培養的CD34+細胞不產生新的集落（圖 5E) 〇
[0125] 對于測試體外擴增的人CD34+細胞在體內產生成熟人造血譜系的能力的實驗，使 用NOD/SCID/gc-/-小鼠（NSG)作為接受小鼠。這是有記載的可用于這個目的的小鼠模 型（Tanaka，S.，et al. (2012). Development of mature and functional huamn myeloid subsets in hematopoietic stem cell-engrafted NOD/SCID/IL2rgK0 mice. J Tmmunol 188,6145-55 (Tanaka，S.等人，2012年，在植入了造血干細胞的N0D/SCID/IL2rgK0小鼠體 內發育成熟和功能性人髓樣細胞亞群，《免疫學雜志》，第188卷，第6145-55頁））。
[0126] 將胎兒臍帶血細胞（FCB)注射到在就要進行注射之前接受了 180拉德的輻照的 NOD/SCID/gc-/-小鼠（NSG)(杰克遜實驗室）體內。將擴增的FCB在PBS中洗滌3次，并 在200 μ I PBS中通過尾靜脈注射。移植后八周，小鼠經尾靜脈放血，以使用以下抗體通過 流式細胞術評估重構情況：抗人CD3 (hCD3) (Biolegend目錄號300312)、抗人CD19 (hCD19) (Biolegend 目錄號 302208)和抗人 CD45(hCD45) (Biolegend 目錄號 304028)。
[0127] 在用IX 107個未經分級分離的臍帶血細胞產生的NSG嵌合小鼠中觀察到表達人 ⑶45+的T細胞和B細胞的短期發育。但是，通過與Tat-Myc和Tat-Bcl-2培養14天在體 外產生的1X106個蛋白轉導長期（ptlt)-HSC的引入，導致了異種嵌合NSG小鼠中出現更 高頻率的人CD45+細胞。另外，在移植后在小鼠的外周血中可觀察到人CD45+細胞達20周 之久（圖6A)。在異種嵌合小鼠的骨髓中發現人CD45+、CD34+CD38lciHSC (圖6B)，在脾臟中 發現人⑶45+/⑶3+和人⑶45+/⑶19+淋巴樣細胞，并且在胸腺中發現人⑶45+、⑶3+淋巴 樣細胞。
[0128] 用CFSE標記來自異種嵌合NSG小鼠的脾臟的人⑶45+⑶19+細胞，并用抗人⑶40 和IgM的單克隆抗體活化。在72小時時通過流式細胞術分析細胞的CFSE稀釋情況。圖6C 顯示在異種嵌合NSG小鼠體內發育的人B細胞的增殖狀況。
[0129] 使用來自異種嵌合NSG小鼠的骨髓的人CD45+、0)34+0)3813(:在MethoCult Optimum中接種。這些細胞在MethoCult平板中產生集落（圖6D)，并且一些集落在連續再 次平板接種后仍可觀察到（圖6E)。在這兩種情況下，用與Tat-Myc和Tat-Bcl-2培養14 天的人臍帶血細胞重構的NSG小鼠的集落數目都比從用新鮮的、未經操縱的人臍帶血細胞 重構的NSG小鼠獲得的細胞要顯著地更高。
[0130] 另外，對一群植入了 106個之前在補加有Tat-Myc和Tat-Bcl-2的細胞因子混合 物中體外擴增的臍帶血細胞的異種嵌合小鼠（黑色正方形）評估了髓樣細胞和淋巴樣細胞 分化。對骨髓細胞（圖6F)和脾臟細胞（圖6G)的CD45陽性群體分析CDllb、CD33、CD3和 CD19表達。在這些異種嵌合小鼠的骨髓和脾臟中都觀察到髓樣細胞和淋巴樣細胞分化。 實例8 :用Tat-Mvc和Tat-Bcl-2擴增人G-CSF動員的外周血HSC [0131 ] G-CSF動員的細胞被接收在來自5名為了自體HSC移植而進行了 G-CSF動員的患 者的Iml體積的經淘洗血液中。所有G-CSF樣品均去除身份標識，并且沒有另外的身份標 識信息與用于這些研究的細胞相關。將細胞滴加到IOml的FCB培養基。將細胞在FCB培 養基中洗滌兩次，并且用IOml體積的5 μ g/ml重組Tat-Myc和10 μ g/ml重組Tat-Bcl-2 處理。根據生產商的推薦，將細胞（5X IO6個）接種在G-Rex 100細胞擴增裝置（Wilson Wolf Manufacturing)中。
[0132] 將細胞在補加有細胞因子加上Tat-Myc和Tat_Bcl2的培養基中擴增14天。擴增 的HSC的FACS譜顯示hCD45+、CD34+、CD38hi、CD133+細胞的獨特群體（圖7A)。細胞擴增 的動力學在圖7B中示出。
[0133] 然后將擴增的成人GCS-F動員的HSC接種在MethoCult Optimum上以表征它們的 體外分化潛力。獲得了四種通常在支持髓類紅細胞分化的培養基中觀察到的集落類型（圖 7C)，并且這些集落類型中的一些在連續再次平板接種時也觀察到。
[0134] 擴增的成人HSC能夠重構經亞致死性輻照的NSG小鼠。圖7D顯示12周前用106 個擴增的G-CSF和Tat-Myc/Tat-Bcl-2動員的HSC (第一小圖）或5 X 106個新鮮的未經操 縱的臍帶血細胞（第二小圖）移植的NSG小鼠的骨髓的CD45+染色的FACS分析。
[0135] 將由用Tat-Myc和Tat-BcI-2培養的G-CSF動員細胞所產生的NSG異種嵌合小鼠 行安樂死，收集骨髓、脾臟和胸腺作進一步分析。對來自用擴增的成人HSC重構的異種嵌合 NSG小鼠的淋巴器官的分析表明，在這些小鼠的骨髓中有人⑶45+、⑶34+⑶381°細胞（圖 7E ;第一小圖）；在脾臟（圖7E ;第二小圖）和胸腺（圖7E ;第三小圖）中有人CD45+、CD3+ 淋巴樣細胞。這些數據合在一起證明了可以成功地擴增從人G-CSF動員的成人血液獲得的 HSC群體。
[0136] 對植入了 IO6個在補加有Tat-Myc和Tat-Bcl-2的細胞因子混合物中（黑色正方 形）體外擴增的G-CSF動員的細胞的一群異種嵌合小鼠評估髓樣細胞和淋巴樣細胞分化。 對骨髓細胞（圖7F)和脾臟細胞（圖7G)的CD45陽性群體分析CDllb、CD33、CD3和CD19 表達。在這些異種嵌合小鼠的骨髓和脾臟中都觀察到髓樣細胞和淋巴樣細胞分化。另外， 源自原代異種移植物的成熟人B細胞在體外響應抗原受體的刺激，如通過流式細胞術測得 的CSFE稀釋所確定（圖6C)。當將從第一連續移植物發育的成熟人B細胞在體外用抗IgM 和CD40的抗體活化時，得到類似的觀察結果（圖8)。
[0137] 這個方法能夠產生根據當前的方法移植中等體形成人（Sideri，A.， et al. (2011) .An overview of the progress on double umbilical cord blood transplantation. Hematologica 96,1213-20) (Sideri，A.等人，2011 年，"雙臍帶血移植進 展綜述"，《血液學》，第96卷，第1213-20頁））所需的足夠數量的HSC。 實例9 :牛物活件Mvc融合蛋白的產牛
[0138] 除了實例1中描述的Tat-Myc融合蛋白以外，還使用本文描述的相同方法產生并 純化了五種Myc融合蛋白。通過使用含有框內N末端PTD氨基酸序列的正向引物和移除終 止密碼子的反向引物對編碼區進行PCR擴增來制備質粒。然后將PCR產物克隆到pETlOl/ D-Topo (英杰公司）載體中，該載體包括C末端V5表位和6x組氨酸純化標簽。圖9A顯示 與實例1的Tat-Myc相比該Myc融合蛋白的示意圖。在每個融合蛋白中，蛋白轉導（PTD) 在Myc多肽之前或之后框內融合。
[0139] 蛋白轉導結構域包括Tat、EPTD和Vpr。EPTD是經優化的蛋白轉導結構域 (YARAAARQARA SEQ ID NO :6)，取自 Ho，A.等人（Synthetic protein transduction domains ：enhanced transduction potential in vitro and in vivo.Cancer Res. (2001)61 :474-477)(合成的蛋白轉導結構域：在體外和體內的增強的轉導潛力，《癌 癥研究》，2001年，第61卷，第474-477頁）。Vpr轉導結構域由Taguchi，T.等人鑒定 (Nuclear trafficking of macromolecules by an oligopeptide derived from Vpr of human immunodeficiency virus type-1. Biochem. Biophys. Res. Commun. (2004)320 (I)： 18-26( "通過源自人免疫缺陷病毒I型的Vpr的寡肽進行大分子的核運輸"，《生物化學與 生物物理學研究通訊》，2004年，第320卷，第1期，第18-26頁））。
[0140] Myc為實例1中描述的多肽的0RF，或者為先前由Huang，Z.等人（Negative control of the Myc protein by the stress-responsive kinase Pak~2. Mol Cell Biol (2004) 24 (4) :1582-94( "脅迫響應性激酶Pak-2對Myc蛋白的負控制"，《分子細胞生 物學》，2004年，第24卷，第4期，第1582-94頁））描述的3AMyc序列的0RF。該重組蛋白 還編碼V5肽標簽和6組氨酸標簽以利于檢測和純化。（圖9A)。 實例10 :活化T細朐存活測宙
[0141] 在活化T細胞存活測定中測試了實例9中描述的Myc融合蛋白（Tat-Myc、 Tat_3AMyc、EPTD-Myc、Vpr-Myc 和 Myc-Vpr)的 Myc 生物活性（圖 9B)。從一只 C57BL. 6j (Jackson)小鼠收獲脾臟，并通過金屬絲網進行機械解離。去除紅細胞，用1 μ g/ ml抗⑶3 (2cll)活化T細胞。將細胞以每孔Iml培養基中3X 10-6個細胞的密度接種到 24孔的簇培養皿（cluster dish)中。48小時后，將活細胞捕集在聚蔗糖墊層上，洗滌并以 每孔1至I. 5 X KT6個細胞的密度接種在24孔的簇培養皿中。將PTD-Myc蛋白以0. 5、1、 5、10、25或50 μ g/ml滴定到T細胞上。PTD-Myc蛋白處理后48小時，通過流式細胞術（前 向加側向散射）評估細胞的活力。在圖9B中，給出的數據是針對25 μ g/ml蛋白處理。
[0142] 如圖9B中所示，除了 Tat_3AMyc以外，所有經測試的構建體在48小時后均導致比 未經處理的