對照更大的T細胞活力。但是，沒有一個構建體導致比實例1中描述的Tat-Myc 更大的T細胞活力。
[0143] 在類似的實驗中，下表5中顯示了不同濃度的Tat-Myc和Tat-Bcl-2的活性。用 lμg/ml的抗CD3(2cll)活化來自C57BL.6j(Jackson)小鼠的脾臟的T細胞。活化后（48 小時后），將細胞洗滌，以約1至I. 5 X IO6個細胞/孔的密度接種，并添加不同濃度（0. 5、 1、5、10、25或5(^8/!111)的融合蛋白〇'&卜1^(3或了&卜8(31-2)。48小時后，通過流式細胞術 (前向加側向散射）測定活細胞的百分比，如下表5中所示。
[0144] 對于Tat-Myc和Tat-Bcl-2兩者，并且在所有的測試濃度下，與在任一融合蛋白不 存在下溫育的細胞相比，細胞活力和/或增殖提高。
[0145] 在使用相同方法的另一實驗中，圖10提供了用50 μ g/ml的融合蛋白處理的活化T 細胞的活門（live gate)的FACS數據；Tat-Bcl-2和Tat-Myc與對照（Tat-Cre或無處理） 比較。如圖所示，Tat-Myc處理和Tat-Bcl-2處理均導致顯著改進的T細胞存活和/或增 殖。 實例11 :用于⑶34+擴增的細朐_子混合物的評估
[0146] 測試了多種在基礎培養基中的細胞因子混合物支持干細胞存活和/或增殖的能 力。
[0147] 在第0天，將臍帶血覆蓋在聚蔗糖（Ficoll)梯度上以富集單核細胞和去除紅細 胞。然后將細胞洗滌并在單獨的StemSpan培養基或具有各種細胞因子組合的StemSpan培 養基中溫育，如下表6中所示。
[0148] 為產生細胞因子，將293FT細胞在DlO培養基（DMEM、10 % FBSUOO單位/毫升 的 Penn/Str印、MEM NEAA(Gibco)、2mM L-谷氨酰胺（Gibco))中以 12X106個細胞 / 板 的密度接種在150mm平板中。使用磷酸鈣，將細胞用30 μ g總DNA/板進行轉染，該30 μ g 總 DNA 由 pcDNA3. 1-SCF、10 μ g pcDNA3. 1-IL3 和 10 μ g pcDNA3. 1-IL6 組成或者由 10 μ g pcDNA3. 1-TPO、10 μ g pcDNA3. 1-Flt3-L 和 10 μ g pcDNA3. I-GM-CSF 組成。第二天，移除培 養基并用100ml DlO培養基更換。將細胞在37°C /5% CO2下溫育4至5天。收集培養基， 過濾滅菌，以30ml等分試樣在-20 °C下冷凍。通過每500ml瓶子的培養基加入30ml的含有 三種細胞因子IL3、IL6、SCF的經調理的培養基和30ml的含有TP0、Flt3-L、GM-CSF的經調 理的培養基，將細胞因子添加到擴增培養基。
[0149] 在第4、7、10、13、16和19天，使用標準的技術獲取樣品，通過流式細胞術測定 ⑶34+細胞的百分比。在第0天后不補充細胞因子。如表6中所示，StemSpan培養基加上 11-3、11-6、TPO (促血小板生成素）、Flt3-L和GM-CSF的組合對細胞顯示最佳的存活和增 殖（參見例如第13天）。
[0150] 測試了在具有或不具有Tat融合蛋白（TMTB)的基礎培養基中的多種細胞因子混 合物支持干細胞存活和/或增殖的能力。
[0151] 在聚蔗糖密度梯度上制備臍帶血以移除紅細胞。將20, 000個有核細胞平板接 種到24孔平皿的各孔中。細胞接種在含有以下成分的StemSpan中：干細胞因子、IL3和 IL6(S36) ;S36 加上 5μg/ml Tat-Myc 和 5μg/ml Tat-Bcl2;TP0、干細胞因子、Flt3-L、 IL3 和 IL6 (TSF36) ;TSF36 加上 5 μ g/ml Tat-Myc 和 5 μ g/ml Tat-Bcl2 ;ΤΡ0、干細胞因子、 Flt3-L、IL3、IL6、GM-CSF(TSF36G);及TSF36G加上5μg/ml Tat-Myc和5μg/ml Tat-Bcl2。 每三天更換培養基和Tat融合蛋白。在第13天，通過流式細胞術評估細胞尋找CD34陽性 譜系陰性HSC。
[0152] 如圖11中所示，TSF36G加上融合蛋白提供最高的活力和增殖。在其他實驗中，細 胞因子加上融合蛋白的這一組合被證實在集落形成測定法中和在異種嵌合小鼠的體內重 構中產生比從不具有融合蛋白的細胞因子混合物產生的細胞明顯更勝一籌的細胞（圖12 至 14)。
[0153] 對于異種嵌合小鼠體內重構實驗，在聚蔗糖梯度上制備臍帶血細胞。移取血沉棕 黃層，將細胞在PBS中洗滌3次。將一半的臍帶血細胞接種在由補加有以下成分的伊思考夫 培養基（Gibco)組成的FCB (胎兒臍帶血）培養基中：10%人血漿、100單位/毫升的Penn/ Str印、30ml的含SCF、IL3和IL6的培養基及30ml的含TPO、FLT3-L和GM-CSF的培養基。 將另一半的細胞接種在包含上述添加物且進一步補加有5 μ g/ml的重組Tat-Myc和5 μ g/ ml的重組Tat-Bcl-2的FCB培養基中。
[0154] 將細胞擴增11天。在第13天，將細胞離心沉淀并重新懸浮在IOml的新鮮FCB 培養基中。將原先用Tat-Myc和Tat_Bcl2處理的細胞再次用5 μ g/ml的重組Tat-Myc和 5 μ g/ml的重組Tat-Bcl-2在37°C下處理1小時。將兩個FCB細胞群體在PBS中洗滌3次 以便注射到小鼠體內。
[0155] 將擴增的細胞注射到在就要進行注射之前接受了 180拉德的輻照的N0D/SCID/ gc /小鼠（NSG)(杰克遜實驗室）體內。擴增的細胞是在200 μ I PBS中經尾靜脈注射到 NSG小鼠體內。移植后八周，通過流式細胞術評估骨髓（BM)、脾臟和胸腺的人HSC重構情況 (圖12至14)。來自在輸注之前已用Tat-Myc和Tat-Bcl2預處理的每種組織的細胞與沒 有用該融合蛋白預處理的細胞相比顯示出人CD45+細胞顯著增加。 實例12 :Bcl-2的評估
[0156] 用Tat_Bcl2轉導3T3細胞1小時，然后進行3次PBS洗滌。轉導后兩小時，將細 胞進行胰蛋白酶消化，計數，并收獲5X106個細胞。分離細胞核級分和細胞質級分。接著 5天，每24小時收獲5 X IO6個細胞。通過將細胞在IOmM HEPES (pH 7. 6)、10mM NaCl 2、3mM CaCljP 0. 5% NP40中裂解，制備細胞核蛋白和細胞質蛋白。使細胞核沉淀，并用三氯乙酸 (TCA)沉淀含細胞質的上清液級分。用抗V5抗體（英杰公司）和山羊抗小鼠 IgG-HRP (圣 克魯斯生物技術公司）探測蛋白質印跡。
[0157] 在24和48小時，在細胞質級分中觀察到Tat_Bcl2。到轉導后72小時為止，信號 開始減弱，并且在96小時時間點不再觀察到信號。
[0158] 產生 了表達 Tat-Bcl2、Tat-Bcl2A、EPTD-Bcl2、VPR-Bcl2、VPR-Bcl2A 和 VPR-BclXL 的質粒。pPTD-Bcl2-V5-6xHis(AmpR):通過使用編碼框內 PTD(Tat、EPTDSVPR) 蛋白轉導結構域的正向引物對編碼人Bcl2的cDNA進行PCR擴增來產生質粒。將PCR產物 克隆到pET101/D-Topo (英杰公司）載體中。為產生Bcl2 Δ，使用Quick Change定點誘變 試劑盒（Stratagene#200521-5)從BCL-2編碼序列去除未結構化的環（第27至80號氨基 酸）。VPR-BclXL按與以上描述的PTD-Bcl2相似的方式制備，但使用人BclXL的cDNA而不 是 Bcl2 的 cDNA。
[0159] 在本申請中，單數的使用可包括復數，除非另有明確說明，或者除非如本領域技術 人員根據本公開內容將會理解的，該單數是唯一的功能性實施例。因此，例如，"一個（種） 可意指超過一個（種），并且" 一個實施例"可意指該描述適用于多個實施例。 以引用方式并入
[0160] 本文引述的所有參考文獻，包括專利、專利申請、文章、教科書等，以及其中引述的 參考文獻，只要未曾被并入本文中，都以引用方式整體并入本文。倘若所并入的文獻和類似 資料中的一者或多者與本申請不同或抵觸，包括但不限于所定義的術語、術語用法、所描述 的技術等，則以本申請為準。 等同物
[0161] 前文的描述和實例詳細說明了某些實施例。但是，應認識到，無論前述內容在文本 上可能看起來有多詳細，本發明都可以按多種方式來實施，并且本發明應按照所附的權利 要求及其任何等同物來解釋。
【主權項】
1. 一種產生條件性無限增殖化成人干細胞群體的方法，所述方法包括： 向一種或多種成人干細胞提供： a) 外源合成的能促進細胞存活或增殖中的一者或多者的Myc多肽；和 b) 外源合成的能抑制凋亡的Bcl-2結構域多肽；并且 其中所述Myc多肽以至少約72小時的時間間隔提供給所述一種或多種成人干細胞；并 且 其中所述Bcl-2結構域多肽以至少約96小時的時間間隔提供給所述一種或多種成人 干細胞，以產生條件性無限增殖化成人干細胞群體。2. 根據權利要求1所述的方法，其中所述Myc多肽以至少約48小時的時間間隔提供。3. 根據權利要求1所述的方法，其中所述Myc多肽以至少約24小時的時間間隔提供。4. 根據權利要求1所述的方法，其中所述Myc多肽連續提供。5. 根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述Bcl-2結構域多肽以至少約72 小時的時間間隔提供。6. 根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述Bcl-2結構域多肽以至少約48 小時的時間間隔提供。7. 根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述Bcl-2結構域多肽以至少約24 小時的時間間隔提供。8. 根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述Bcl-2結構域多肽連續提供。9. 根據權利要求1至8中任一項所述的方法，其中所述Myc多肽是n-Myc、c-Myc、 I-Myc、v-Myc或s-Myc中的一者或多者。10. 根據權利要求1至9中任一項所述的方法，其中所述Myc多肽以約Iyg/ml至約 50yg/ml的濃度提供。11. 根據權利要求1至9中任一項所述的方法，其中所述Myc多肽以約5yg/ml的濃度 提供。12. 根據權利要求1至11中任一項所述的方法，其中所述Bcl-2結構域多肽以約Iyg/ ml至約50yg/ml的濃度提供。13. 根據權利要求1至11中任一項所述的方法，其中所述Bcl-2結構域多肽以約 10yg/ml的濃度提供。14. 根據權利要求1至13中任一項所述的方法，其中所述Bcl-2結構域多肽包括BH1、 BH2、BH3 和BH4。15. 根據權利要求1至14中任一項所述的方法，其中所述一種或多種Bcl-2結構域多 肽是Bcl-2、Bcl-w、Bcl-X、Bcl-XL、Mcl-I中的一者或多者。16. 根據權利要求1至14中任一項所述的方法，其中所述一種或多種Bcl-2結構域多 妝是Bcl_2。17. 根據權利要求1至16中任一項所述的方法，其中所述Myc多肽或所述Bcl-2多肽 中的一者或多者包含蛋白轉導結構域。18. 根據權利要求17所述的方法，其中所述蛋白轉導結構域是Tat。19. 根據權利要求17所述的方法，其中所述蛋白轉導結構域是EPID。20. 根據權利要求17所述的方法，其中所述蛋白轉導結構域是vpr。21. 根據權利要求1至20中任一項所述的方法，其中所述一種或多種成人干細胞在包 含IL3、IL6和干細胞因子的培養基中培養。22. 根據權利要求1至20中任一項所述的方法，其中所述一種或多種成人干細胞在包 含IL3、IL6、干細胞因子、促血小板生成素和Flt3-L的培養基中培養。23. 根據權利要求1至20中任一項所述的方法，其中所述一種或多種成人干細胞在包 含IL3、IL6、干細胞因子、促血小板生成素和Flt3-L及GM-CSF的培養基中培養。24. 根據權利要求1至23中任一項所述的方法，其中所述一種或多種成人干細胞的擴 增情況為以下一種或多種情況：在約28天里擴增約270倍、在約14天里擴增約150倍、在 約21天里擴增100倍或者在約9至14天里擴增約85倍。25. 根據權利要求1至24中任一項所述的方法，其中所述一種或多種成人干細胞是一 種或多種造血成人干細胞。26. 根據權利要求25所述的方法，其中所述造血成人干細胞通過以下一方面或多方面 來表征：細胞表面表型、體外分化能力、輻照后在體內重構造血譜系的能力或以連續方式移 植的能力。27. 根據權利要求1至26中任一項所述的方法，其中所述一種或多種造血成人干細胞 從以下一者或多者中分離：臍帶血、胎盤、骨髓、外周血、動員外周血或脂肪組織。28. 根據權利要求1至26中任一項所述的方法，其中所述一種或多種造血成人干細胞 源自胚胎干細胞或誘導多能干細胞。29. 根據權利要求1至28中任一項所述的方法，其中所述一種或多種成人干細胞是人 細胞。30. 根據權利要求1至28中任一項所述的方法，其中所述一種或多種成人干細胞是非 人動物細胞。31. -種Myc融合蛋白，所述Myc融合蛋白包含： 蛋白轉導結構域； 能促進細胞存活或增殖中的一者或多者的Myc多肽； V5結構域；和 六組氨酸表位標簽。32. 根據權利要求31所述的Myc融合蛋白，其具有超過約60分鐘的半壽期。33. 根據權利要求31所述的Myc融合蛋白，其具有約48小時的半壽期。34. 根據權利要求31所述的Myc融合蛋白，其中所述Myc融合蛋白在長達約72小時里 是可檢測的。35. 根據權利要求31所述的Myc融合蛋白，其中所述Myc融合蛋白在長達約48小時里 是可檢測的。36. 根據權利要求31至34中任一項所述的Myc融合蛋白，其中所述Myc融合蛋白可運 輸到細胞中的細胞核中。37. 根據權利要求31至35中任一項所述的Myc融合蛋白，其中所述蛋白轉導結構域是 Tat〇38. 根據權利要求31至35中任一項所述的Myc融合蛋白，其中所述蛋白轉導結構域是 Vpr039. 根據權利要求31至35中任一項所述的Myc融合蛋白，其中所述蛋白轉導結構域是 EPTD040. 根據權利要求31至38中任一項所述的Myc融合蛋白，其中所述Myc融合蛋白具有 如下的組分順序： a) 所述蛋白轉導結構域框內連接到所述Myc多肽， b) 所述Myc多肽框內連接到所述V5結構域，和 c) 所述V5結構域框內連接到所述六組氨酸表位標簽。41. 根據權利要求31至38中任一項所述的Myc融合蛋白，其中所述Myc融合蛋白具有 如下的組分順序： a) 所述Myc多肽框內連接到所述蛋白轉導結構域， b) 所述蛋白轉導結構域框內連接到所述V5結構域，和 c) 所述V5結構域框內連接到所述六組氨酸表位標簽。42. -種干細胞擴增培養基，所述干細胞擴增培養基包含IL3、IL6、干細胞因子、促血 小板生成素、Flt3-L和GM-CSF。43. 根據權利要求42所述的干細胞擴增培養基，其進一步包含基礎培養基。44. 根據權利要求43所述的干細胞擴增培養基，其進一步包含： 能促進細胞存活或增殖中的一者或多者的Myc多肽。45. 根據權利要求41至44中任一項所述的干細胞擴增培養基，其進一步包含： 能抑制凋亡的Bcl-2結構域多肽。46. 根據權利要求41至45中任一項所述的干細胞擴增培養基，其中所述基礎培養基是 StemSpan、Isco培養基、RPMI或DMEM中的一者或多者。47. -種Myc融合蛋白，所述Myc融合蛋白包含： a) 蛋白轉導結構域 b) 能促進細胞存活或增殖中的一者或多者的Myc多肽，其中所述Myc融合蛋白的半壽 期超過約60分鐘。48. -種核酸，所述核酸編碼根據權利要求31至41和47中任一項所述的蛋白質。49. 一種載體，所述載體包含根據權利要求48所述的核酸。50. -種細胞，所述細胞包含根據權利要求49所述的載體。51. 根據權利要求1所述的方法，其中在8小時時間里提供不超過Iyg/ml的Myc多 肽。52. 根據權利要求1所述的方法，其中在16小時時間里提供不超過Iyg/ml的Myc多 肽。53. 根據權利要求1所述的方法，其中在24小時時間里提供不超過Iyg/ml的Myc多 肽。54. 根據權利要求1所述的方法，其中產生所述群體是在透氣容器內進行。55. -種Myc融合蛋白，所述Myc融合蛋白包含： 蛋白轉導結構域； 能促進細胞存活或增殖中的一者或多者的Myc多肽；和 短肽結構域。56. 根據權利要求55所述的Myc融合蛋白，其中所述短肽結構域選自HA標簽、FLAG標 簽、CBP、CYD、Str印II或HPC中的至少一者。57. -種透氣容器，所述透氣容器含有： 包含如下物質的干細胞擴增培養基：IL3、IL6、干細胞因子、促血小板生成素、Flt3-L和GM-CSF; 能促進細胞存活或增殖中的一者或多者的Myc多肽；和 能抑制凋亡的Bcl-2結構域多肽。58. 根據權利要求57所述的透氣容器，其中所述容器是袋或燒瓶。
【專利摘要】本發明公開了用于操縱和擴增包括成人干細胞在內的干細胞群體的方法、通過這種方法產生的細胞以及與其相關的各種蛋白質構建體。
【IPC分類】C12N5/00, C12N5/071
【公開號】CN105209604
【申請號】CN201480026147
【發明人】布賴恩·柯蒂斯·特納, 優素褔·里菲利, G·A·伯德
【申請人】泰加生物工藝學公司
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2014年3月11日
【公告號】CA2905296A1, EP2970885A1, US9365825, US20140273212, WO2014164606A1