r> 取⑴所述完全培養液50ml加入(3)所述濃度為50mM的IBMX溶液250μ1，⑵所述濃度為ImM的地塞米松溶液50μ1和(I)所述濃度為170μΜ胰島素溶液250μ1，制得含0.25mM ΙΒΜΧ、?μΜ地塞米松以及850ηΜ胰島素的誘導分化液。
[0028](6)維持培養液:
取(I)所述完全培養液50ml加入(I)所述濃度為170uM胰島素溶液250μ1，制得含850ηΜ胰島素的維持培養液。
[0029](7)含三磷酸腺苷誘導分化液的配制:
稱取24.2mg三磷酸腺苷溶解于40ml (5)所述的誘導分化液中，制得濃度為ImM三磷酸腺苷溶液，用0.22 ym的微孔過濾器除。再分別加入(5)所述的誘導分化液將含1.0mM三磷酸腺苷的誘導分化液分別稀釋20，10，6.7和5倍，使其濃度分別為50μΜ，ΙΟΟμΜ, 150μΜ和 200μΜο
[0030](8)含三磷酸腺苷維持培養液的配制:
稱取24.2mg三磷酸腺苷溶解于40ml (6)所述的維持培養液中，使其濃度為1禮，0.22μΜ濾膜過濾除菌。再分別加入(6)所述的維持培養液將含LOmM三磷酸腺苷的維持培養液分別稀釋20，10，6.7和5倍，使其濃度分別為50μΜ, ΙΟΟμΜ, 150μΜ和200μΜ。
[0031](9)油紅O染液:
取0.7g油紅O加入200mL異丙醇中，室溫靜置過夜，用雙層濾紙過濾，收集濾液成為原液，室溫下儲存；臨用前取6份原液加入4份ddH20混勻，現配現用。
[0032](10) Baker’ s福爾馬林鈣液:
將40%甲醛10ml、Llg氯化鈣加入90mlddH20中，調節PH至7.0，制得4%Baker’s福爾馬林鈣液。
[0033](11) 3T3-L1脂肪前體細胞:
購自中國科學院上海細胞庫。
[0034]
實施例2:3T3-L1前脂肪細胞的復蘇及細胞培養:
(I)將凍存細胞從液氮取出，迅速放置于37°C的水浴鍋中，待凍存液快速溶解后，將細胞倒入15ml無菌離心管中，在冷凍離心機中用1000rpm/min離心3min。
[0035](2)棄上清液，加入PBS后重懸再次以1000rpm/min離心3min。
[0036](3)棄上清液加新鮮完全培養液，制成單細胞懸液，以I X 15個/ml接種在培養瓶中，間隔2~3天換液一次。
[0037](4)待細胞增殖至鋪滿培養瓶底部，向瓶內加入Iml左右0.25%的胰酶，并置于倒置顯微鏡下觀察，當細胞回縮變圓，加入等量完全培養液，終止消化，用吸管反復吹打瓶底，收集細胞懸液至無菌離心管，以1000rpm/min離心3min，棄上清液，用2_3ml完全培養液使細胞重新懸浮，再按I X 15個/ml密度傳至新培養瓶繼續培養。
[0038]實施例3:3T3-L1前脂肪細胞的誘導分化:
(I)將3T3-11前脂肪細胞按照2 X 14個/孔的密度接種至48孔板，每孔加入300 μ I完全培養液。
[0039](2)待細胞貼壁生長至融合，吸棄培養液，換為含不同濃度三磷酸腺苷(0，50μΜ，100μΜ，150μΜ和200μΜ)的誘導分化培養液。
[0040](3) 2天后換為含上述濃度三磷酸腺苷的維持培養液，之后每2天換一次液，直至第8天為止。
[0041]實施例4:尼羅紅熒光染色檢測脂肪細胞內甘油三酯含量:
(I)將誘導分化至8d的培養板取出，棄去培養液，用PBS洗滌2次。
[0042](2)用200 μ IPBS覆蓋48孔，每孔加入12 μ I尼羅紅染料。
[0043](3)在37°C培養箱孵育10分鐘，避免光照。
[0044](4)用全波段酶標儀檢測熒光值強度(激發波長485nm，發射波長572nm)，記錄熒光值強度。
[0045]實施例5:油紅O染色:
(I)將誘導分化至8天的培養板取出，棄去培養液，用PBS洗滌2次，于4 °C下，用10%Baker’ s福爾馬林I丐液固定細胞30min。
[0046](2)將培養皿中的福爾馬林液棄去，并用移液槍將剩余的液體吸干再用PBS清洗3遍。
[0047](3)吸棄PBS，每孔加入新鮮油紅O染液200μ1覆蓋細胞表面，室溫下染色lOmin，吸出染液，并用PBS沖洗2遍。
[0048](4)放置在倒置顯微鏡下觀察結果，拍攝照片。
[0049]實施例6:脂滴直徑、數量及面積統計:
運用Image-Pro Plus 6.0圖像處理軟件統計經油紅O染色后脂滴脂滴直徑、數量以及脂滴面積。
【主權項】
1.一種3T3-L1前脂肪細胞誘導分化試劑的配方，其特征在于:由三磷酸腺苷、胰島素、IBMX和地塞米松組成。2.根據權利要求1所述，其特征在于:各成分比例依次為三磷酸腺苷50_200μΜ，胰島素為 0.17-1.5mM，IBMX 0.25-lmM，地塞米松 0.1_2μΜ。3.根據權利要求1所述，其特征在于:各成分最優濃度依次為三磷酸腺苷ιοομΜ，胰島素為 850nM，IBMX 0.25mM，地塞米松 ?μΜ。4.根據權利要求1所述，其特征在于:各成分最優濃度依次為三磷酸腺苷150μΜ，胰島素為 850nM，IBMX 0.25mM，地塞米松 ?μΜ。5.根據權利要求1、2、3、4所述，權利要求該組合在3T3-L1前脂肪細胞培養及誘導分化中的應用。6.根據權利要求1、2、3、4所述，權利要求該組合在肥胖疾病的體外細胞模型關于該組合應用。
【專利摘要】提供一種能促進3T3-L1前脂肪細胞分化的組合，配方為含三磷酸腺苷（Adenosine-？triphosphate,ATP）的誘導分化試劑，其主要成分為三磷酸腺苷、胰島素、地塞米松和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)。該組合物是在傳統“雞尾酒”誘導試劑基礎上加入三磷酸腺苷組成的。經該誘導組合物誘導分化8天，可使約90%？3T3-L1前脂肪細胞分化為典型的成熟脂肪細胞，細胞體積增大，胞體變圓，胞漿內脂滴明顯，與經典“雞尾酒”誘導法比較融合形成更大脂滴。本發明具有較好的分化效果和分化效率。
【IPC分類】C12N5/077
【公開號】CN105238745
【申請號】CN201510565191
【發明人】王宇豪, 王訊, 何劉軍, 肖娟, 李明洲
【申請人】四川農業大學
【公開日】2016年1月13日
【申請日】2015年9月8日