選到淺層黑色培養板中培養6天，酶標儀在入射光波長488nm，出射光波長530nm 測定各轉化子培養物的熒光值，其中，熒光值高于400的轉化子培養物所對應的轉化子為外 源基因高表達的純系轉化子。
[0030]本發明至少包括以下有益效果：
[0031]本發明提供的重組載體，能夠將外源基因轉化入絲狀真菌中，并且，利用所述重組 載體在絲狀真菌中對外源基因是否能夠成功表達進行快速篩選，比傳統的篩選方法大大縮 短了篩選時間，提高了篩選的工作效率，同時，篩選過程中獲得的可表達外源基因的轉化子 可通過復篩，獲得高產量純系轉化子，以適應實際生產的需要。
[0032]通過本發明提供的利用重組載體在絲狀真菌中篩選外源基因的方法，可以建立一 套檢測外源基因表達以及高表達量純系轉化子的快速篩選系統，該系統可以有效加快絲狀 真菌的遺傳改造進程，促進構建絲狀真菌細胞工廠的發展。
[0033]本發明的其它優點、目標和特征將部分通過下面的說明體現，部分還將通過對本 發明的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。
【附圖說明】
[0034]圖1為本發明所述在絲狀真菌中成功表達的外源基因的快速篩選方法中構建的質 粒pS頂PLE-19-Ppki-gfp-Tcbh2 的模式圖；
[0035]圖2為本發明所述在絲狀真菌中成功表達的外源基因的快速篩選方法中構建的質 粒pS頂PLE-19-Ppki-hph-Tcbh2 的模式圖；
[0036]圖3為本發明所述在絲狀真菌中成功表達的外源基因的快速篩選方法中構建的質 粒pS頂PLE-19-Ptefl-gfp-Tegll的模式圖；
[0037] 圖4為pS頂PLE-19-Ppki-far-gfp-Tcbh2質粒（4-1)、pSMPLE-19-Ppki-hph-Tcbh2 質粒(4-2)和pS頂PLE-19-Ptefl-gfp-Tegll質粒(4-3)分別經HindIII、XbaI、SpeI酶切驗證 的瓊脂糖電泳圖；
[0038]圖5為本發明所述在絲狀真菌中成功表達的外源基因的快速篩選方法中一個實施 例中轉化子孢子I的分析圖I;
[0039]圖6為本發明所述在絲狀真菌中成功表達的外源基因的快速篩選方法中另一個實 施例中轉化子孢子I的分析圖I;
[0040]圖7本發明所述在絲狀真菌中成功表達的外源基因的快速篩選方法中一個實施例 中的絲狀真菌孢子的分析圖Π;
[0041]圖8為本發明所述在絲狀真菌中成功表達的外源基因的快速篩選方法中另一個實 施例中轉化子孢子Π的分析圖m;
[0042]圖9本發明所述在絲狀真菌中成功表達的外源基因的快速篩選方法中一個實施例 中的絲狀真菌孢子的分析圖m。
[0043] 圖10GC-FID分析復篩獲得的里氏木霉轉化子的脂肪醇提取物的色譜圖。
【具體實施方式】
[0044]下面結合附圖對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文 字能夠據以實施。
[0045]應當理解，本文所使用的諸如"具有"、"包含"以及"包括"術語并不配出一個或多 個其它元件或其組合的存在或添加。
[0046]本發明提供一種重組載體，其包括啟動子、外源基因、熒光蛋白和終止子，所述外 源基因位于啟動子的下游，位于終止子或熒光蛋白的上游;所述熒光蛋白位于所述啟動子 或外源基因的下游，位于所述終止子的上游。
[0047] -個優選方案是，其中，所述外源基因為脂酰輔酶A還原酶基因或與脂酰輔酶A還 原酶的氨基酸序列相似性高于80%的脂酰輔酶A衍生物基因，所述啟動子為翻譯延伸因子1 啟動子和丙酮酸激酶啟動子;所述終止子為內切葡聚糖苷酶I終止子和外切葡聚糖苷酶II 終止子。
[0048] -個優選方案是，其中，所述重組載體還包括熒光蛋白基因，其位于所述啟動子的 下游，位于所述終止子的上游。
[0049]重組載體在里氏木霉中表達目的蛋白的應用。
[0050]利用重組載體在絲狀真菌中快速篩選外源基因的方法，其特征在于，包括以下步 驟：
[0051]步驟一、將權利要求1所述的不含外源基因的重組載體轉入絲狀真菌獲得轉化子 I；
[0052]步驟二、將所述轉化子I培養產孢，應用流式細胞儀分析轉化子孢子I和陰性對照 組獲得分析圖I和分析圖Π，分析圖I中沿橫坐標排布有孢子群I和孢子群Π，根據分布在分 析圖I右側的孢子群Π的分布范圍設定圈定門，在分析圖Π中應用所述圈定門圈定孢子群 ΙΠ；
[0053]步驟三、構建帶有絲狀真菌啟動子、待測外源基因、熒光蛋白表達基因、和終止子 的絲狀真菌的轉化子Π;以及
[0054]步驟四、重復步驟二，應用流式細胞儀分析轉化子孢子Π獲得分析圖m，應用所述 圈定門在分析圖m中圈定范圍，當落入所述圈定門內的孢子群IV中孢子數量超過孢子群m 中孢子數量時，判定所述待測外源基因成功表達，當落入圈定門內的孢子群iv中孢子數量 低于孢子群m中孢子數量時，判定所述待測外源基因沒有成功表達；
[0055]其中，所述轉化子孢子I為實驗組，所述陰性對照組為帶有空載體的絲狀真菌孢 子，所述絲狀真菌的轉化子Π為待檢測組。
[0056] -個優選方案是，其中，所述步驟二中圈定門的最小值為分析圖I中沿橫坐標排布 的孢子群I和孢子群Π之間的接觸處所對應的分析圖I中的橫坐標值。
[0057] -個優選方案是，其中，所述步驟二中應用流式細胞儀分析轉化子孢子I和絲狀真 菌孢子的具體方法為:設置流式細胞儀的樣品壓力為20000EPS，利用前向角散射光面積和 寬度圖，去除粘連和雜信號;熒光信號使用488nm激光激發，FL1通道分析。
[0058] -個優選方案是，其中，所述轉化子的構建方法具體為：
[0059] 7.1)以絲狀真菌的基因組DNA和含熒光蛋白表達基因的質粒為模板PCR擴增獲得 啟動子基因片段、終止子片段和熒光蛋白表達基因片段；
[0060] 7.2)將所述啟動子基因片段、終止子片段和熒光蛋白表達基因片段克隆入載體制 備成質粒;以及
[0061] 7.3)制備絲狀真菌原生質體，應用所述質粒轉化原生質體獲得所述轉化子。
[0062] 一個優選方案是，所述步驟7.2)還包括:在重組酶的作用下，將PCR擴增得到的啟 動子、終止子片段和熒光蛋白表達基因片段組裝成Ppki-gfp-TCbh2、Ppki-hph-Tcbh2或Ptefl-gfp-Tegll的結構克隆到pS頂PLE-19EcoRVBAP載體上；以及將外源待測基因整合 至上述載體gfp的上游位置。
[0063] 一個優選方案是，將分析圖m中落入所述圈定門內的孢子群iv中孢子以單孔單孢 的形式，分選到淺層黑色培養板中培養6天，酶標儀在入射光波長488nm，出射光波長530nm測定各轉化子培養物的熒光值，其中，熒光值高于的轉化子培養物所對應的轉化子為外源 基因高表達的純系轉化子。
[0064]其中，熒光蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示的氨基酸序列。
[0065]應用上述方法進行實驗室整體構建在絲狀真菌中能夠成功表達的外源基因的快 速篩選系統，具體涉及到的所有試驗步驟如下：
[0066]實施例1:里氏木霉表達載體的構建
[0067] (1)表達載體的模塊的克隆
[0068]根據里氏木霉數據庫（http://genome ·jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html) 中的翻譯延伸因子l(Tefl)啟動子、丙酮酸激酶(pki)啟動子、內切葡聚糖苷酶I(egll)終止 子、外切葡聚糖苷酶II(cbh2)終止子