在5?10°C ；
6.凍干
取出透析液，加入少量硅藻土，用布氏漏斗抽濾，得濾液，用5mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至6.0，進凍干機凍干后得結晶過氧化氫酶成品6.2g，經測定其活性效價為2600iu/mg。
[0012]實施例2
1、過氧化氫酶粗制生產操作:
1.提取工序:
1.1新鮮的肝臟，用鑷子和剪刀將脂肪結締組織等除去，置絞碎機中絞碎，稱重10Kg ;
1.2絞碎物置塑料桶中，用0.150mol/L硫酸溶液25L浸漬24小時，在浸漬期中每小時攪拌1次；
1.3將浸漬物置濾袋過濾，濾渣再用0.150mol/L硫酸溶液12.5L浸漬1小時，濾干后棄去濾渣；
2.鹽溶、鹽析工序:
2.1將兩次浸漬液合并，體積為37.4L，置塑料桶中，每1000ml溶液中加入固體硫酸銨225g，達到35%飽和度，共加8.415Kg固體硫酸銨，靜置12小時;
2.2過濾，留取過濾液，濾液體積為36.8L，固體棄去；
2.3在每1000ml清液中加入固體硫酸銨186g，達到65%飽和度，共用硫酸銨6.845kg，靜置12小時；
2.4過濾，留取濾餅，稱重180.2g,棄濾液；
2.5用720.8ml水溶解，再按2.1,2.2,2.3、2.4步驟分次加固體硫酸銨近35%和65%飽和度沉淀；
2.6取65%飽和度沉淀物，稱重90.5g，用181ml水溶解，加入54.3ml飽和硫酸銨溶液，并用5mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至5.10 ;
2.7將溶液靜置25°C恒溫箱中48小時，有針狀的糜蛋白酶粗品結晶析出；
2.8過濾，母液用0.25mol/L硫酸調節pH至2.9，其體積為234.7ml加入硫酸銨82.lg，靜置15小時；
3.干燥工序:
取沉淀物，置真空干燥箱內干燥，即得過氧化氫酶粗品，稱重60.9g，即每千克肝臟可得6.09克過氧化氫酶。
[0013]2、過氧化氫酶精制生產操作:
1.投料
1.1稱取過氧化氫酶粗品60.9g，先用152.25ml純化水攪拌溶解，加3.0mol/L硫酸溶液調節pH至3.1，以助其溶解，攪拌12小時；
1.2計量溶液體積160.3ml，加入固體硫酸銨64.lg，待其溶解后，靜置沉淀12小時；
1.3將溶液真空過濾，稱量濾餅重量50.lg，加純化水21.1ml，攪拌溶解后加2.5mol/L硫酸溶液調節pH至3.2，加入飽和硫酸銨溶液15.8ml，靜止沉淀12小時；
1.4將溶液過濾，量取濾液體積36.5ml，加入飽和硫酸銨溶液36.5ml，靜置沉淀15小時；
1.5洗鎂:將上清液棄去，沉淀物真空抽濾，并在濾餅上加入飽和硫酸鎂溶液，靜置1分鐘，抽濾，待濾液開始流出，將漏斗上剩余的硫酸鎂溶液傾去，將濾餅取出稱重48.2g，待活化；
2.活化
將濾餅溶于241.0ml0.01mol/L鹽酸溶液，另加入1.5mol/L氯化鈣溶液96.4ml及PH8.5硼酸緩沖液192.8ml，再加入337.4ml純化水，調節pH至7.5，最后加480mg活力較高的結晶過氧化氫酶進行活化處理，將溶液在5?10°C中靜置72小時進行活化，第二天測pH值為7.4 ;
3.除鈣
活化后的溶液用3.0mol/L硫酸溶液調節pH至3.2，溶液體積為820ml，再加入固體硫酸銨205.0g,攪拌溶解，在0?10°C中存放54小時使硫酸鈣沉淀，過濾，濾液加入固體硫酸銨160.0g，在0?10°C靜置12小時，過濾，得濾餅重量24.0g ；
4.結晶
濾餅加入pH9.0硼酸緩沖液48.0ml，用3.0mol/L硫酸溶液調節pH至8.1，攪拌均勻，再將溶液裝透析袋，5?10°C浸于外透液中，結晶5天，每2小時搖包一次；
5.透析
取出結晶液過濾得結晶物15.lg,加純化水30.2ml溶解，用3.0mol/L硫酸溶液調節pH至2.9 ;將溶液裝透析袋，然后掛于透析池中透析3天，去除鹽類雜質，每12小時左右透析池換水一次，溫度控制在5?10°C ；
6.凍干
取出透析液，加入少量硅藻土，用布氏漏斗抽濾，得濾液，用5mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至6.2，進凍干機凍干后得結晶過氧化氫酶成品3.8g，經測定其活性效價為2590iu/mg。
[0014]以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，并非是對本發明作其它形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示的技術內容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發明技術方案內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發明技術方案的保護范圍。
【主權項】
1.一種過氧化氫酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:(1)原料絞碎，抽提酶原；(2)分級鹽溶、鹽析；(3)結晶，得過氧化氫酶粗品；(4)粗品投料，多重結晶；(5)活化；(6)結晶；(7)透析；(8)凍干。2.根據權利要求1所述制備方法，其特征在于，各步驟具體為: (1)提取:將動物的肝臟絞碎成肝漿，用硫酸溶液浸漬，過濾，留取濾液； (2)鹽溶、鹽析:濾液中加入硫酸銨，使硫酸銨的飽和度達到20-50%，靜置，過濾，留取濾液；濾液中加入硫酸銨，使硫酸銨的飽和度達到40-80%，靜置，過濾，留取濾餅；所得濾餅加水溶解，加入飽和硫酸銨溶液，調節pH值至3.8-5.4 ; (3)結晶:溶液靜置至有針狀糜蛋白酶結晶析出；離心，調節pH值至2.0-4.0，在溶液中加入固體硫酸銨，抽濾；取沉淀物，干燥，即得過氧化氫酶粗品； (4)投料:取過氧化氫酶粗品，加水溶解，調節pH，攪拌；加入硫酸銨，溶解，靜置；過濾，濾餅加水，攪拌溶解，調節pH，加入飽和硫酸錢溶液，靜置；過濾，濾液中加入飽和硫酸銨溶液，靜置；洗鎂，待活化； (5)活化:將濾餅溶于鹽酸溶液，加入氯化鈣溶液及硼酸緩沖液，再加水，調節pH，最后加入結晶過氧化氫酶進行活化，將溶液靜置； (6)結晶:將活化后的溶液調節pH，加入固體硫酸銨，攪拌溶解，靜置，過濾，濾液加入固體硫酸銨，靜置，過濾，得濾餅；濾餅中加入硼酸緩沖液，調節pH，攪拌均勻，再將溶液裝透析袋，浸于外透液中； (7)透析:過濾得結晶物，加水溶解，調節pH;將溶液透析，去除雜質； (8)凍干:取出透析液，抽濾，得濾液，調節pH，凍干后得結晶過氧化氫酶成品。3.根據權利要求2所述的一種過氧化氫酶的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，所述動物肝臟為新鮮的牛肝臟、新鮮的豬肝臟；硫酸溶液的濃度為0.09-0.21mol/L ;肝漿與硫酸溶液的重量比為1:2~1:3 ;浸漬時間是20~28小時。4.根據權利要求2所述的一種過氧化氫酶的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，水與濾餅的重量比為1:1~3:1 ;調節pH值至4.0-6.0 ;加入的飽和硫酸銨溶液與濾餅的重量比為1:9~1:1。5.根據權利要求2所述的一種過氧化氫酶的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中溶解靜置環境溫度為20~30°C ;調節pH值至2.0-5.0 ?’每1000ml溶液中加入固體硫酸銨的重量為 200~400g。6.根據權利要求2所述的一種過氧化氫酶的制備方法，其特征在于，步驟(4)中，過氧化氫酶粗品與水的重量比為1:2-1:4，調節pH至3.0±0.5，攪拌11?16小時；每升溶液加入400?500g固體硫酸銨，待其溶解后，靜置沉淀11?16小時。7.根據權利要求2所述的一種過氧化氫酶的制備方法，其特征在于，步驟(5)中，稱濾餅重量，加0.001?0.01mol/L鹽酸溶液將濾餅溶解，加入0.5?2mol/L氯化鈣溶液，以及pH7.5?8.5的硼酸緩沖液，再加入水，調節pH7.0?8.0，最后每克濾餅加5?15mg的結晶過氧化氫酶進行活化處理，pH值控制在6.0?8.0 ;所述鹽酸溶液的加入量為濾餅重量的3?5倍，所述氯化鈣溶液的加入量為濾餅重量的1?3倍，所述硼酸緩沖液的加入量為濾餅重量的4?6倍。8.根據權利要求2所述的一種過氧化氫酶的制備方法，其特征在于，步驟(6)中，活化后的溶液調節pH至3.0±0.4，再按200?300g/L加入固體硫酸銨，攪拌溶解，在0?10°C中存放32?60小時使硫酸鈣沉淀，過濾，濾液中按150?250g/L加入固體硫酸銨，0?10°C時放置11?14小時，過濾，得濾餅；按每克濾餅加入1?2mlpH8.0?10.0硼酸緩沖液，調節pH至8.0±0.4，攪拌均勻，再將溶液裝透析袋，浸于外透液中，溫度控制在0?11。。。9.根據權利要求2所述的一種過氧化氫酶的制備方法，其特征在于，步驟(7)中，按每克結晶物加入1?3ml水溶解，調節pH至3.0±0.5，溫度控制在0?11°C，透析2?4天。10.根據權利要求2所述的一種過氧化氫酶的制備方法，其特征在于，步驟(8)中，調節pH 至 6.0±0.5。
【專利摘要】本發明闡述一種過氧化氫酶的制備方法。該制備方法包括以下工藝步驟：（1）原料絞碎，抽提酶原；（2）分級鹽溶、鹽析，得過氧化氫酶粗品；（3）粗品投料，多重結晶；（4）活化；（5）結晶；（6）透析；（7）凍干。本發明建立起一套規模化的生產工藝，具有簡單、低成本等優點，制備的過氧化氫酶精品效價達4600單位/毫克以上，符合《中國藥典》（2010版）要求，具有極大的市場競爭力。
【IPC分類】C12N9/08
【公開號】CN105400747
【申請號】CN201510832538
【發明人】劉乃山, 安迪, 劉翠珍
【申請人】青島康原藥業有限公司
【公開日】2016年3月16日
【申請日】2015年11月26日