耐熱性過氧化氫酶的制作方法

專利名稱：耐熱性過氧化氫酶的制作方法
技術領域：
本發明涉及耐熱性過氧化氫酶，具體地，本發明涉及嗜松青霉或灰腐質霉來源的 耐熱性過氧化氫酶、具有耐熱性過氧化氫酶活性的蛋白質、編碼該蛋白質的DNA以及生產 耐熱性過氧化氫酶的方法
背景技術：
過氧化氫酶是催化將過氧化氫分解成水和氧氣的反應的酶。過氧化氫溶液作為消 毒劑或殺菌劑有著廣泛的應用。過氧化氫溶液在殺菌結束后可以用水簡單地除去，且某種 程度地隨時間自然分解，因而，其作為食品等的殺菌劑有著廣泛的應用。但是，殘留的過氧 化氫所產生的活性氧可能引起細胞老化或癌，因此希望能夠在使用后完全分解、去除過氧 化氫。過氧化氫酶對于過氧化氫的分解是非常有效的，其可以在不添加新化學物質的情況 下將過氧化氫分解。實際上，過氧化氫酶已經用于棉花漂白處理后殘留的過氧化氫、食品中 的殘留過氧化氫的分解和去除。目前為止，作為過氧化氫酶，已知有微生物來源(專利文獻 1 5)和豬、牛的肝臟等動物來源的過氧化氫酶等。在上述的過氧化氫酶中，作為絲狀真菌的黑曲霉(Aspergillus niger)產生的 過氧化氫酶、豬肝臟來源的過氧化氫酶常用于工業用途。但是，這些過氧化氫酶的耐熱 性低，已知其在70°C處理30分鐘后活性僅殘留10%左右(專利文獻6)。另一方面，特 別是在纖維加工、食品加工等用途中，必須利用高溫分解過氧化氫，因此需要比傳統產 品耐熱性更高的過氧化氫酶。目前為止，作為耐熱性過氧化氫酶，已經報導的有土曲霉 (Aspergi 1 lusterreus)(專禾1J文獻 6)、阿拉巴馬頂抱霉(Acremonium alabamensis)(專禾 文獻6)、嗜熱子囊菌(Thermoascus aurantiacus)(專利文獻6)、嗜熱革節孢(Scytalidium thermophilum)(專利文獻7)、特異腐質霉(Humicola insolens)(專利文獻7)和嗜熱絲孢 菌屬(Thermomyces)(專利文獻8)產生的過氧化氫酶。已知絲狀真菌的蛋白質分泌能力極高，適合作為生產酶等重組蛋白質的宿主。因 此，如果能夠將耐熱性過氧化氫酶基因導入絲狀真菌，并以重組蛋白質的形式進行大量表 達，則可以期待與野生株相比能夠以顯著高的生產性生產耐熱性過氧化氫酶。目前為止，在 用于重組蛋白質的生產方面，有報導稱在分類為曲霉屬(專利文獻9)、青霉屬(專利文獻 10)、腐質霉屬(專利文獻11)、木霉屬(專利文獻12)、頂孢霉屬(專利文獻13)的絲狀真 菌中產生重組蛋白質已經取得成功。當以這些絲狀真菌作為宿主表達重組蛋白質時，并非導入宿主中的全部外源基因 均能夠得到表達。一般地，從導入基因所使用的密碼子的角度來看，希望所導入的外源基因 的來源與宿主具有盡可能近的親緣關系。例如，當以特異腐質霉為宿主、以重組蛋白質的形 式表達內切葡聚糖酶時，在導入特異腐質霉來源的NCE4、NCE5基因的情況下，確認到了顯 著量的內切葡聚糖酶的表達(專利文獻14、15)。與此相對，在導入與NCE4、NCE5具有高氨 基酸序列同一性的米根霉(Rhizopus oryzae)來源的RCEI基因的情況下，基本上未確認到 內切葡聚糖酶的表達(專利文獻16)。此外，當以泡盛曲霉(Aspergillus awamori)為宿主、以重組蛋白質的形式表達葡糖淀粉酶時，在導入黑曲霉來源的葡糖淀粉酶基因的情況 下，葡糖淀粉酶的表達顯示出高達4. 6g/L的生產性，與此相對，在導入灰腐質霉來源的基 因的情況下，僅顯示出低至0. 66g/L的生產性(非專利文獻1)。而且，當以重組蛋白質的形 式表達α-淀粉酶時，在以米曲霉(Aspergillus oryzae)為宿主導入米曲霉來源的α-淀 粉酶基因的情況下，α-淀粉酶的表達顯示出高達12g/L的生產性，與此相對，在以綠色木 霉(Trichoderma viride)為宿主導入米曲霉來源的α-淀粉酶基因的情況下，α -淀粉酶 的表達僅顯示出lg/L的生產性(非專利文獻1)。這些結果顯示在以表達顯著量的重組蛋 白質為目標時，希望導入與宿主同種或親緣關系近的絲狀真菌來源的基因。
在以將絲狀真菌作為宿主、以重組蛋白質的形式大量表達耐熱性過氧化氫酶為目 標時，如上述，可以認為希望所導入的耐熱性過氧化氫酶基因的來源與作為宿主的絲狀真 菌親緣關系近。但是，目前為止，報導的分離的耐熱性過氧化氫酶基因僅有嗜熱子囊菌來源 的過氧化氫酶基因(專利文獻17)和嗜熱革節孢來源的過氧化氫酶基因(專利文獻18)。 關于從作為蛋白質的生產宿主開發的曲霉屬、青霉屬、腐質霉屬、木霉屬、頂孢霉屬等絲狀 真菌中分離出耐熱性過氧化氫酶基因的實例目前尚未有報導，以重組蛋白質的形式高生產 性地表達耐熱性過氧化氫酶仍是十分困難的。專利文獻1 日本特開昭55-135588號公報專利文獻2 日本特開昭60-083579號公報專利文獻3 日本特開昭63-003788號公報專利文獻4 日本特公昭49-004956號公報專利文獻5 日本特開平2-076579號公報專利文獻6 日本特開平5-153975號公報專利文獻7 日本特表平6-506347號公報專利文獻8 日本特開平10-257883號公報專利文獻9 國際公開第W097/034004號小冊子專利文獻10 國際公開第W02000/068401號小冊子專利文獻11 國際公開第W098/003667號小冊子專利文獻12 國際公開第W098/011239號小冊子專利文獻13 日本特開2001/017180號公報專利文獻14 國際公開第W098/003640號小冊子專利文獻15 國際公開第W02001/090375號小冊子專利文獻16 國際公開第W02000/024879號小冊子專利文獻17 特開2004-261137號公報專利文獻18 美國專利第5646025號說明書非專利文獻1 塚越規弘著，組換λ夕> /、1質生産法(學會出版中心)，ρρ· 94 9
發明內容
發明所要解決的問題在這樣的背景下，希望以重組蛋白質的形式大量表達耐熱性過氧化氫酶，本發明人等的課題是從作為重組蛋白質生產宿主而開發的曲霉屬、青霉屬、腐質霉屬、木霉屬、頂孢霉屬絲狀真菌中尋找耐熱性過氧化氫酶，分離出編碼這些耐熱性過氧化氫酶的基因，并 大量表達耐熱性過氧化氫酶。解決問題的方法為了解決上述課題，本發明人等大量培養了分類為作為重組蛋白質生產宿主而開 發的絲狀真菌的曲霉屬、青霉屬、腐質霉屬、木霉屬、頂孢霉屬的絲狀真菌，并對所得培養液 中的過氧化氫酶的熱穩定性進行了反復評價，嘗試了從這些絲狀真菌獲得耐熱性過氧化氫 酶。結果發現嗜松青霉和灰腐質霉產生耐熱性過氧化氫酶。接下來，本發明人等從嗜松青霉的培養液中純化了耐熱性過氧化氫酶，結果得到 了在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)中在約SOkDa的位置上顯示單一條帶、且N末 端氨基酸序列為DDSNASSETEAFLSEFYLNDNDAYLTTDVGG(SEQ ID NO 5)的耐熱性過氧化氫 酶。此外，從灰腐質霉的培養液中純化了耐熱性過氧化氫酶，結果得到了在SDS-PAGE中在 約80kDa的位置上顯示單一條帶、且N末端氨基酸序列為QDTTSGQSPLAAYEVDDSTG(SEQ ID NO 10)的耐熱性過氧化氫酶。而且，本發明人等成功從嗜松青霉和灰腐質霉的基因組DNA中克隆了編碼這些耐 熱性過氧化氫酶的基因，并成功測定了其堿基序列，從而完成了本發明。S卩，本發明涉及如下方面。1)屬于青霉屬的微生物產生的耐熱性過氧化氫酶。2)1)所述的耐熱性過氧化氫酶，其中，屬于青霉屬的微生物是嗜松青霉 (Penicillium pinophilum)。3) 1)或2)所述的耐熱性過氧化氫酶，其分子量為約80kDa。4)灰腐質霉(Humicola grisea)產生的耐熱性過氧化氫酶。5) 4)所述的耐熱性過氧化氫酶，其分子量為約80kDa。6)選自以下的(i)、(ii)和(iii)中的蛋白質(i)包含SEQ ID NO 2所述的氨基酸序列的1 692位的序列的蛋白質；(ii)包含在SEQ ID NO 2所述的氨基酸序列的1 692位的序列中缺失、取代或 添加1個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列、且具有耐熱性過氧化氫酶活性的蛋白質；(iii)包含與SEQ ID NO 2所述的氨基酸序列的1 692位的序列具有70%以上 同一性的氨基酸序列、且具有耐熱性過氧化氫酶活性的蛋白質。7)由SEQ ID NO 2所述的氨基酸序列的1 692位的序列組成的、具有耐熱性過
氧化氫酶活性的蛋白質。8)6)或7)所述的蛋白質，其中，該蛋白質的N末端側具有SEQ ID NO :2所述的氨 基酸序列的-1 -42位的序列、或在SEQ ID NO 2所述的氨基酸序列的_1 _42位的序 列中缺失、取代或添加1個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列。9)選自以下的(i)、(ii)和(iii)中的蛋白質(i)包含SEQ ID NO 4所述的氨基酸序列的1 684位的序列的蛋白質；(ii)包含在SEQ ID NO 4所述的氨基酸序列的1 684位的序列中缺失、取代或 添加1個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列、且具有耐熱性過氧化氫酶活性的蛋白質；(iii)包含與SEQ ID NO :4所述的氨基酸序列的1 684位的序列具有70%以上 同一性的氨基酸序列、且具有耐熱性過氧化氫酶活性的蛋白質。
10)由SEQ ID NO 4所述的氨基酸序列的1 684位的序列組成的、具有耐熱性 過氧化氫酶活性的蛋白質。11)根據9)或10)所述的蛋白質，該蛋白質的N末端側具有SEQ IDNO :4所述的 氨基酸序列的-1 -32位的序列、或在SEQ ID NO 4所述的氨基酸序列的_1 32位的序 列中缺失、取代或添加1個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列。12)選自以下的⑴、(ii)和(iii)中的DNA:(i)編碼6) 8)中任一項所述的蛋白質的DNA ；
(ii)包含SEQ ID NO 1所述的堿基序列的1 2403位的序列的DNA ；(iii)與由SEQ ID NO 1所述的堿基序列的1 2403位的序列組成的DNA在嚴 格條件下雜交的、且編碼具有耐熱性過氧化氫酶活性的蛋白質的DNA。13)由SEQ ID NO 1所述的堿基序列的1 2403位的序列組成的DNA。14)從12)或13)所述的DNA中除去內含子序列而得到的DNA。15)14)所述的DNA，其中，內含子序列是選自SEQ ID NO :1所述的堿基序列的 322 372位、599 651位、1068 1113位或1279 1326位的序列中的1個以上的序 列。16)從12) 15)中任一項所述的DNA中除去編碼信號序列的堿基序列而得到的 DNA。17) 16)所述的DNA，其中，編碼信號序列的堿基序列是SEQ ID NO :1所述的堿基序 列的1 126位的序列。18)選自以下的⑴、(ii)和(iii)中的DNA:(i)編碼9) 11)中任一項所述的蛋白質的DNA ；(ii)包含SEQ ID NO 3所述的堿基序列的1 2749位的序列的DNA ；(iii)與由SEQ ID NO 3所述的堿基序列的1 2749位的序列組成的DNA在嚴 格條件下雜交、且編碼具有耐熱性過氧化氫酶活性的蛋白質的DNA。19)由SEQ ID NO 3所述的堿基序列的1 2749位的序列組成的DNA。20)從18)或19)所述的DNA中除去內含子序列而得到的DNA。21)20)所述的DNA，其中，內含子序列是選自SEQ ID NO 3所述的283 463位、 667 747位、771 846位、1008 1160位、1218 1270位或1842 1895位的序列中 的1個以上的序列。22)從18) 21)所述的DNA中除去編碼信號序列的堿基序列而得到的DNA。23)22)所述的DNA，其中，編碼信號序列的堿基序列是SEQ ID NO :3所述的1 96 位的序列。24)包含12) 17)中任一項所述的DNA的表達載體。25)用12) 17)中任一項所述的DNA或24)所述的表達載體轉化了的宿主微生 物。26)25)所述的宿主微生物，其中，宿主微生物是絲狀真菌。27)26)所述的宿主微生物，其中，絲狀真菌是選自屬于曲霉屬、青霉屬、腐質霉屬、 木霉屬或頂孢霉屬的絲狀真菌中的絲狀真菌。28)耐熱性過氧化氫酶的生產方法，該生產方法包括培養25) 27)中任一項所述的宿主微生物，并從培養物收集耐熱性過氧化氫酶。29)包含18) 23)中任一項所述的DNA的表達載體。30)用18) 23)中任一項所述的DNA或29)所述的表達載體轉化了的宿主微生 物。31)30)所述的宿主微生物，其中，宿主微生物是絲狀真菌(糸狀菌)。32)31)所述的宿主微生物，其中，絲狀真菌是選自屬于曲霉屬(Aspergillus)、 青霉屬(Penicillium)、腐質霉屬(Humicola)、木霉屬(Trichoderma)或頂孢霉屬 (Acremonium)的絲狀真菌中的絲狀真菌。 33)耐熱性過氧化氫酶的生產方法，該生產方法包括培養30) 32)中任一項所 述的宿主微生物，并從培養物中收集耐熱性過氧化氫酶。發明效果根據本發明，能夠得到以重組蛋白質的形式高效地生產耐熱性過氧化氫酶所必需 的DNA，此外，能夠得到高效表達耐熱性過氧化氫酶的重組微生物。而且，通過培養所得的重 組微生物，能夠高效且廉價地生產耐熱性過氧化氫酶。通過用本發明的耐熱性過氧化氫酶 處理含過氧化氫的溶液，即使在高溫下也能夠有效且廉價地分解過氧化氫。


[圖1]質粒pPCN的限制酶圖譜。[圖2]質粒pHCN的限制酶圖譜。[圖3]質粒pPTPCN的限制酶圖譜。發明的
具體實施例方式在本說明書中，“耐熱性過氧化氫酶”是指采用專利文獻6實施例4公開的方法 測定耐熱性，70°C保存30分鐘后的活性殘留率為50%以上的過氧化氫酶。嗜松青霉和灰腐質霉在培養液中產生的耐熱性過氧化氫酶可以采用例如專利文 獻6公開的方法來獲得。過氧化氫酶活性的測定可以這樣進行在含過氧化氫的溶液中添 加過氧化氫酶，通過對一定時間后減少的過氧化氫進行定量來進行評價，例如，可以采用專 利文獻6中公開的方法來測定。此外，耐熱性過氧化氫酶還可以通過按照專利文獻6所述 的方法，將稀釋成適當濃度的培養上清于70°C熱處理30分鐘，并測定熱處理前后的過氧化 氫酶活性，來進行評價。在本說明書中，按照上述定義，將該熱處理中殘留50%以上活性的 過氧化氫酶作為耐熱性過氧化氫酶。對于通過上述方法獲得的嗜松青霉和灰腐質霉的培養液上清，測定了其上清中的 過氧化氫酶的熱穩定性。結果是，通過70°C熱處理30分鐘，嗜松青霉產生的過氧化氫酶殘 留了 50%的過氧化氫酶活性，而灰腐質霉產生的過氧化氫酶殘留了 57%的過氧化氫酶活 性，嗜松青霉和灰腐質霉產生耐熱性過氧化氫酶。耐熱性過氧化氫酶的純化可以從采用上述方法獲得的含耐熱性過氧化氫酶的培 養上清出發，按照蛋白質純化的常規方法來實施。此時，所采用的蛋白質純化方法可以使用 公知的各種方法，例如可以通過組合疏水層析、陰離子交換色譜來實施。此外，純化得到的 耐熱性過氧化氫酶的分子量可以通過SDS-PAGE來測定。采用上述方法純化了嗜松青霉和灰腐質霉所產生的耐熱性過氧化氫酶，并測定了其分子量，結果從嗜松青霉和灰腐質霉分別獲得了具有約SOkDa的分子量的耐熱性過氧化
氫酶。 在本說明書中，“在氨基酸序列中缺失、取代或添加1個或多個氨基酸而得到的氨 基酸序列”是指通過能夠通過定點誘變法等公知方法或天然產生而實現的程度的多個數 目的氨基酸的取代等而進行了修飾。氨基酸修飾的個數優選1 50個、更優選1 30個、 更優選1 10個、更優選1 5個、最優選1 2個。本發明的蛋白質的修飾氨基酸序列的例子優選可以是其氨基酸具有1或多個(優 選1或數個或者1、2、3或4個)保守取代的氨基酸序列。在本說明書中，“保守取代”是指將1個或多個氨基酸殘基用其它化學上類似的 氨基酸殘基取代。可以列舉出例如將某個疏水性殘基用其它疏水性殘基取代的情況，將 某個極性殘基用具有相同電荷的其它極性殘基取代的情況。能夠進行這樣的取代的功能 上類似的氨基酸，按氨基酸分類是本技術領域公知的。具體的例子，作為非極性(疏水性) 氨基酸可以列舉出丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸 等。作為極性(中性)氨基酸，可以列舉出甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬 酰胺、半胱氨酸等。作為具有正電荷(堿性)的氨基酸，可以列舉出精氨酸、組氨酸、賴氨酸 等。此外，作為具有負電荷(酸性)的氨基酸，可以列舉出天冬氨酸、谷氨酸等。本說明書中“嚴格條件”是指在高溫下、低鹽濃度溶液中進行雜交后的膜的洗滌 操作，例如是指0. 5 X SSC濃度(IX SSC :15mmol/L檸檬酸三鈉、150mmol/L氯化鈉)、60°C、 15分鐘的洗滌條件，優選0. 5 X SSC濃度、0. 1% SDS溶液中60°C、15分鐘的洗滌條件。雜交可以按照公知方法來進行。此外，在使用市售文庫的情況下，可以按照附帶的 使用說明書所述的方法來進行。在本說明書中，針對堿基序列或氨基酸序列而言的“同一性”是指在所比較的序 列之間，構成各序列的堿基或氨基酸殘基的一致程度。在本說明書中示出的任何“同一性” 的數值，均只要是使用本領域技術人員公知的同源性檢索程序計算出的數值即可，例如，可 以在FASTA等中使用默認(初期設定)參數，來容易地計算得出。與SEQ ID NO 2所述的氨基酸序列的1 692位的序列具有70%以上同一性的 氨基酸序列優選是具有80 %以上、更優選85 %以上、更優選90 %以上、更優選95 %以上、特 別優選98%以上、最優選99%以上的同一性的氨基酸序列。與SEQ ID NO 4所述的氨基酸序列的1 684位的序列具有70%以上的同一性 的氨基酸序列優選是具有80%以上、更優選85%以上、更優選90%以上、更優選95%以上、 特別優選98%以上、最優選99%以上的同一性的氨基酸序列。在本發明中，如果給出SEQ ID NO 2所述的氨基酸序列的1 692位的序列，則可 以容易地確定編碼其的堿基序列，可以選擇出編碼SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列的1 692位的序列的各種堿基序列。在本發明中，如果給出SEQ ID NO :4所述的氨基酸序列的1 684位的序列，則可 以容易地確定編碼其的堿基序列，可以選擇出編碼SEQ ID NO :4所述的氨基酸序列的1 684位的序列的各種堿基序列。因此，編碼包含SEQ ID NO 2所述的氨基酸序列的1 692位的序列的蛋白質的 DNA是指SEQ ID NO=I所述的堿基序列的1 2403位的序列所表示的堿基序列的一部分或全部，還指具有作為編碼同一氨基酸的堿基序列的、且處于簡并關系的密碼子作為堿基 序列的序列。本發明中還包括與上述對應的RNA序列。此外，編碼包含SEQ ID NO 4所述的氨基酸序列的1 684位的序列的蛋白質的 DNA是指SEQ ID NO 3所述的堿基序列的1 2749位的序列所表示的堿基序列的一部分 或全部，還指具有作為編碼同一氨基酸的堿基序列的、且處于簡并關系的密碼子作為堿基 序列的序列。本發明中還包括與上述對應的RNA序列。作為編碼包含SEQ ID NO :2所述的氨基酸序列的1 692位的序列的蛋白質的 DNA的優選例子，可以列舉出包含SEQ ID NO :1所述的堿基序列的1 2403位的序列所表 示的堿基序列的DNA。作為編碼包含SEQ ID NO :4所述的氨基酸序列的1 684位的序列的蛋白質的 DNA的優選例子，可以列舉出包含SEQ ID NO 3所述的堿基序列的1 2749位的序列所表 示的堿基序列的DNA。編碼嗜松青霉和灰腐質霉所產生的耐熱性過氧化氫酶的基因的分離，可以通過從 嗜松青霉和灰腐質霉制作基因組噬菌體文庫、獲得包含耐熱性過氧化氫酶基因的陽性噬菌 體克隆來實施。作為用于從基因組噬菌體文庫篩選陽性噬菌體克隆的探針，可以使用耐熱 性過氧化氫酶基因片段。作為探針的耐熱性過氧化氫酶基因片段可以通過以各基因組DNA 為模板進行PCR來擴增。用于PCR的引物組可以基于已知的絲狀真菌來源過氧化氫酶基因 的保守序列來設計。從這樣獲得的陽性克隆將耐熱性過氧化氫酶基因亞克隆至大腸桿菌載 體中后，通過對所得載體的堿基序列進行分析，可以確定耐熱性過氧化氫酶基因的堿基序 列。此外，基于由該堿基序列推定的氨基酸序列與已知的過氧化氫酶的氨基酸序列之間的 比較、以及內含子的保守序列，可以推定該堿基序列中的內含子序列。此外，從該基因的翻 譯起始密碼子起直至編碼純化的耐熱性過氧化氫酶的N末端氨基酸序列的序列之前，可以 推定為編碼信號序列的序列。通過上述方法從嗜松青霉的基因組DNA分離出的全長耐熱性過氧化氫酶基因PCN 由序列表的SEQ ID NO 1所記載的2403bp的堿基組成，此外，推定該基因包含SEQ ID NO 1的322 372位、599 651位、1068 1113位和1279 1326位的堿基序列所示的4個 內含子。由該基因序列推定的耐熱性過氧化氫酶的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。此 夕卜，該氨基酸序列的1 31位的序列與從嗜松青霉純化的耐熱性過氧化氫酶的N末端氨基 酸序列完全一致，因而推定SEQ ID NO :2的-1 -42位的氨基酸序列是信號序列，并推定 編碼該氨基酸序列的SEQ ID NO :1的1 126位的堿基序列是編碼信號序列的堿基序列。基于本說明書所示的嗜松青霉來源的過氧化氫酶基因PCN的堿基序列，制作用于 擴增目標基因的引物，以嗜松青霉的基因組DNA作為模板來實施PCR，并將擴增出的DNA片 段與適當的載體連接，這樣可以制作表達載體，并可以分離目標基因。而且，本發明的嗜松 青霉來源的DNA包含于質粒pPCN中，可以將其用作PCR的模板DNA。此外，可以利用適當的 限制酶從所述質粒制備目標DNA片段。根椐本發明，提供用pPCN轉化了的大腸桿菌(Esc^r/c/zia co//)菌林， 該菌林于平成20年(2008年)2月7日在獨立行政法人產業技術綜合研究所 專利生物保藏中心(；〒305-8566日本國茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央 第6)進行了日本國內保藏(國內保藏號FERM P-21504),并于平成2O年(2008 年)12月11日起移交國際保藏(國際保藏號FERM BP-11074)。
采用上述方法從灰腐質霉的基因組DNA分離出的全長耐熱性過氧化氫
酶基因HCN由序列表SEQ ID NO: 3所示的2749bp的堿基組成，此外，推
定該基因包含SEQ ID NO :3的283 463位、667 747位、771 846位、1008 1160位、 1218 1270位、1842 1895位的堿基序列所示的6個內含子。由該基因序列推定的耐熱 性過氧化氫酶的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。此外，該氨基酸序列的1 20位的序 列與由灰腐質霉純化的耐熱性過氧化氫酶的N末端氨基酸序列完全一致，因而推定SEQ ID NO :4的-1 -32位的氨基酸序列是信號序列，而推定編碼該氨基酸序列的SEQ ID NO 3 的1 96位的堿基序列是編碼信號序列的堿基序列。基于本說明書所示的灰腐質霉來源的過氧化氫酶基因HCN的堿基序列，制作用于 擴增目標基因的引物，以灰腐質霉的基因組DNA作為模板來實施PCR，并將擴增出的DNA片 段與適當的載體相連接，這樣可以制作表達載體，并可以分離目標基因。而且，本發明的灰腐質霉來源的DNA包含于質粒pHCN中，可以將其用作PCR的模板DNA。此外，可以利用適當 的限制酶從所述質粒制備目標DNA片段。
此外，根據本發明，提供用pHCN轉化了的大腸桿菌coli), 該菌林于平成20(2008)年2月7日在獨立行政法人產業技術綜合研究所專利 生物保藏中心(亍305-8566日本國茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第6) 進行了日本國內保藏(國內保藏號FERM P-21503),并于平成20年(2008 年)12月11日起移交國際保藏(國際保藏號FERM BP-11073)。對于如上述地分離出的耐熱性過氧化氫酶基因，通過將其導入宿主進行表達，可 以生產耐熱性過氧化氫酶。導入宿主的DNA可以是全長的耐熱性過氧化氫酶基因，也可以 是從該DNA除去內含子序列的一部分或全部而得到的DNA，還可以是從該DNA除去編碼信號 序列的堿基序列而得到的DNA。根據本發明，提供表達載體，該表達載體以可在宿主微生物內復制、且可表達本發 明的DNA所編碼的蛋白質的狀態包含所述的本發明的DNA。而且，根據本發明，還提供用該 表達載體轉化了的微生物。對該宿主-載體系統沒有特殊限制，例如可以使用利用大腸桿菌、放線菌、酵母、 霉菌等的系統、以及利用它們的與其它蛋白質的融合蛋白質表達系等。作為適于本發明的 宿主微生物，可以列舉出絲狀真菌、優選木霉屬、曲霉屬、青霉屬(更優選嗜松青霉)、腐質 霉屬(更優選灰腐質霉)、頂孢霉屬絲狀真菌等，作為表達載體，可以使用專利文獻9 13 所述的表達載體等。本發明的載體構建的規程和方法，可以使用基因工程領域慣用的規程和方法。
為了將本發明的表達載體切實導入宿主微生物并表達目標蛋白質，本發明的表達 載體除了包含所述的本發明的DNA之外，還可以包含調控其表達的DNA、用于選擇微生物的 基因標記等用適當的培養基培養這樣獲得的轉化體，可以從其培養物分離得到上述本發明的 蛋白質。轉化體的培養及其條件，可以根據所使用的微生物適宜設定。此外，從培養液回收、 純化目的蛋白質，也可以按照常規方法進行。
實施例以下，為了加深對本發明的理解，借助實施例進行說明，但本發明不受這些實施例 的限定。實施例1 嗜松青霉培養液中的過氧化氫酶活性(耐熱性)的測定將在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上生長的嗜松青霉接種于裝有包含蔗糖50g/L、麥 芽提取物20g/L、酵母提取物5g/L的培養基30mL的200mL三角燒瓶中，26°C振蕩培養5天 后，從所得培養液離心分離除去菌體，得到了培養上清液。對于所得培養上清液中的過氧化 氫酶，采用專利文獻6的實施例4公開的方法測定了其過氧化氫酶活性(耐熱性)，結果是， 70°C保存30分鐘后的活性殘留率為50%。根據以上結果，可以判定嗜松青霉產生耐熱性的 過氧化氫酶。實施例2 嗜松青霉培養液中的耐熱性過氧化氫酶的分離純化在采用實施例1所述的方法獲得的嗜松青霉的培養上清液中溶解終濃度lmol/L 的硫酸銨后，通過使該溶液通過預先用包含lmol/L硫酸銨的50mmol/L磷酸緩沖液(pH7. 0) 平衡的疏水柱 Phenyl Sepharose HP 26/10 (GEHealthcare Bio-Science 公司制造)，來進 行吸附。接著，利用從包含lmol/L硫酸銨的50mmol/L磷酸緩沖液(pH7. 0)至50mmol/L磷 酸緩沖液(PH7.0)的線性梯度洗脫法對吸附于該疏水柱的蛋白質進行洗脫并分級。采用 實施例1所述的方法測定分級的洗脫液的過氧化氫酶活性，回收了顯示活性的級分。在回 收的活性級分中添加終濃度lmol/L的硫酸銨，采用與上述相同的方法利用疏水柱實施了 再層析。對所得活性級分采用超濾進行濃縮脫鹽后，添加終濃度50mmol/L的磷酸緩沖液 (PH8.0)。接下來，使該溶液通過預先用50mmol/L磷酸緩沖液(pH8. 0)平衡的陰離子交換 柱MonoQ(GE HealthcareBio-Science公司制造)，吸附了蛋白質。采用從50mmol/L磷酸 緩沖液(PH8. 0)至包含lmol/L NaCl的50mmol/L磷酸緩沖液(ρΗ8. 0)的線性梯度洗脫法 對吸附的蛋白質進行洗脫并分級。采用實施例1所述的方法測定分級的洗脫液的過氧化氫 酶活性(耐熱性)，回收了顯示活性的級分。對回收的活性級分采用SDS-PAGE進行了分析， 結果顯示約SOkDa的單一條帶，因而判斷來源于該條帶的蛋白質是耐熱性過氧化氫酶。用 SDS-PAGE分離出該耐熱性過氧化氫酶后，將其印跡在聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，分析了 N 末端的氨基酸序列，得到了以下的序列。DDSNASSETEAFLSEFYLNDNDAYLTTDVGG(SEQ ID NO 5)實施例3 從嗜松青霉中克隆耐熱性過氧化氫酶基因PCN3-1)基因組DNA文庫的制作從嗜松青霉的菌體中采用堀內等的方法[H. Horiuchi et. al.，J. Bacteriol.， 170,272-278, (1988)]分離純化了基因組DNA。對于分離出的基因組DNA利用限制酶SM3AI進行了部分消化。使用連接試劑盒Ver.2(TAKARA Bio公司制造)將其連接到噬菌 體載體· EMBL3克隆試劑盒(Stratagene公司制造)的臂上。用乙醇將其沉淀后， 溶解于TE緩沖液中。對于連接混合物的總量，使用MaxPlax λ packerging kit (Epicenter technology公司制造)使之形成噬菌體粒子，并感染大腸桿菌XLl_blue MRA (P2)株。通過 該方法得到了包括1. 1 X IO4個噬菌體的基因組DNA文庫。3-2)探針的制作基于已知的過氧化氫酶的保守區域的序列制作了以下引物。P 過氧化氫酶 F GAGGCCGGCAACTACCCNGARTGGRA (SEQ IDNO 6)P 過氧化氫酶 R =CCTGCTCGGTCTCGGCRAARffARTT (SEQ ID NO 7) 使用P過氧化氫酶F和P過氧化氫酶R作為引物，以基因組DNA作為模板進行 PCR0 PCR使用LA Taq聚合酶(TAKARA Bio公司制造)實施。PCR以94°C 30秒、退火30秒、 720C 1分鐘實施40個循環的程序來實施，退火溫度在最初的20個循環中從63°C梯次降低 至53°C，此后的20個循環中固定在53°C。對于擴增出的250bp的DNA片段，使用TOPO TA 克隆試劑盒(Irwitrogen公司制造)按照附帶規程將其插入pCR2. 1-T0P0質粒載體，得到 了質粒TOPO-P過氧化氫酶。克隆到質粒TOPO-P過氧化氫酶中的插入DNA片段的測序，使用BigDye (R) Terminator v3. ICycle Sequencing Kit (Applied Biosystems 公司制造)禾口 ABI PRISM 基因分析儀(Applied Biosystems公司制造)按照附帶規程進行。對結果得到的堿基序 列進行同源性檢索，結果與棒曲霉(Aspergillusclavatus)來源的過氧化氫酶顯示71 % 的同一性，因而判斷該DNA片段是過氧化氫酶基因的一部分。以質粒Τ0Ρ0-Ρ過氧化氫 酶作為模板采用與上述相同的方法通過PCR擴增該DNA片段，將所得PCR產物用ECL DirectSystem(Amersham Pharmacia Biotech 公司制造)標記，作為探針。3-3)利用斑點雜交進行篩選將實施例3-1中制作的噬菌體斑點轉印到Hybond N+尼龍轉印膜(Amersham公司 制造)上，堿變性后，用5倍濃度SSC(SSC :15mmol/L檸檬酸三鈉、150mmol/L氯化鈉)進行 洗滌，并進行干燥從而將DNA固定。雜交是在1小時的預雜交(42°C )后，添加辣根過氧化 物酶(HRP)標記探針，進行4小時(42°C )雜交。探針的洗滌是用添加6mol/L尿素、0. 4% SDS的0. 5倍濃度SSC進行2次，再用2倍濃度SSC進行2次。對于進行過探針洗滌的尼龍膜，將其在檢測溶液中浸漬1分鐘浸漬后，用同一公 司制造的HYPER Film ECL進行感光，得到了 1個陽性克隆。使用LE392作為宿主大腸桿 菌，按照 Maniatis 等的方法(J. Sambrook, E. F. Fritschand T. Maniatis, “ Molecular Cloning"，Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989)從陽性克隆制備 DNA。首先， 將LE392用LB-MM培養基(1%蛋白胨、0. 5%酵母提取物、0. 5 %氯化鈉、lOmmol/L硫酸鎂、 0. 2%麥芽糖)培養過夜。使之感染單個斑點來源的噬菌體溶液，用LB-MM培養基培養過夜。 向其中加入終濃度lmol/L的氯化鈉，再加入終濃度0. 8%的氯仿，促進大腸桿菌的溶菌。通 過離心分離除去菌體殘渣，從聚乙二醇(PEG)沉淀(10%PEG6000)回收了噬菌體粒子。在 SDS存在下，用蛋白酶K消化噬菌體粒子，并通過對其進行苯酚處理、乙醇沉淀來回收了噬 菌體DNA。對于如上制備的DNA，使用ECL Direct System進行了 Southern印跡分析。以實施例3-2的PCR擴增片段作為探針進行雜交，結果約7kb的MI片段顯示出與染色體DNA 共同的雜交圖樣將該MI片段克隆在pUC118上，得到了質粒pUC-PCN。對于所得質粒，采用實施 例3-2所述的方法分析了其堿基序列。而且，為了亞克隆嗜松青霉來源的過氧化氫酶基因 PCN，以pUC-PCN為模板，利用以下的引物組(PCNF以及PCNR)實施了 PCR，擴增出PCN基因。PCNF :ATGCGAGGATTATACTCCCTC (SEQ ID NO 8)PCNR :CTACTCATCCACAGCGAATCG(SEQ ID NO 9)使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen公司制造)將擴增出的DNA插入 PCR2. 1-T0P0質粒載體，得到了質粒pPCN。用所得質粒pPCN轉化大腸桿菌(Escherichia coli)T0P 10 株(Invitrogen 公司)，從而得到了 Escherichia coliTOPIO 株/pPCN。3-4)耐熱性過氧化氫酶的氨基酸序列的推定采用上述方法從嗜松青霉基因組DNA分離得到的全長耐熱性過氧化氫酶基因PCN 由SEQ ID NO :1所示的2403bp的堿基組成。基于由該堿基序列推定的氨基酸序列與已知過 氧化氫酶的氨基酸序列之間的比較、以及內含子的保守序列，推定該基因包含SEQ ID NO 1 的322 372位、599 651位、1068 1113位、1279 1326位所示的4個內含子。由該 堿基序列推定的耐熱性過氧化氫酶的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。此外，SEQ ID NO 2的氨基酸序列的1位 31位的序列與實施例2所示的從嗜松青霉純化得到的耐熱性過 氧化氫酶的N末端氨基酸序列完全一致，因而推定SEQ ID NO 2的氨基酸序列的_1 _42 位的序列是信號序列，并推定編碼該氨基酸序列的SEQ ID NO :1的1 126位的堿基序列 是編碼信號序列的堿基序列。實施例4 灰腐質霉培養液中的過氧化氫酶活性(耐熱性)的測定采用與實施例1相同的方法制備了灰腐質霉的培養上清液。對于所得培養上清液 中的過氧化氫酶，采用實施例1的方法測定了其過氧化氫酶活性(耐熱性)，結果于70°C保 存30分鐘后的活性殘留率是57%。根據以上結果判斷，灰腐質霉產生耐熱性過氧化氫酶。實施例5 灰腐質霉培養液中的耐熱性過氧化氫酶的分離純化在采用實施例4所述的方法獲得的灰腐質霉的培養上清液中溶解終濃度lmol/L 的硫酸銨后，通過使該溶液通過預先用包含lmol/L硫酸銨的50mmol/L磷酸緩沖液(pH7. 0) 平衡的疏水柱 Phenyl Sepharose HP 26/10 (GEHealthcare Bio-Science 公司制造)，來進 行吸附。接著，利用從包含lmol/L硫酸銨的50mmol/L磷酸緩沖液(pH7. 0)至50mmol/L磷 酸緩沖液(PH7.0)的線性梯度洗脫法對吸附于該疏水柱的蛋白質進行洗脫并分級。采用實 施例1所述的方法測定了分級的洗脫液的過氧化氫酶活性(耐熱性)，回收了顯示活性的級 分。在回收的活性級分中添加終濃度lmol/L的硫酸銨，采用與上述相同的方法利用疏水柱 實施了再層析。對所得活性級分采用超濾進行濃縮脫鹽后，添加終濃度50mmol/L的醋酸緩 沖液(pH4.0)。接下來，使該溶液通過預先用50mmol/L醋酸緩沖液(pH4. 0)平衡的陽離子 交換柱MonoS (GEHealthcare Bio-Science公司制造)。因為在非吸附級分中檢測到了過氧 化氫酶活性，所以回收了非吸附級分作為活性級分。對回收的活性級分采用SDS-PAGE進行 了分析，結果顯示約SOkDa的單一條帶，因而判斷來源于該條帶的蛋白質是耐熱性過氧化 氫酶。用SDS-PAGE分離出該耐熱性過氧化氫酶后，將其印跡在PVDF膜上，分析了 N末端的 氨基酸序列，得到了以下的序列。
QDTTSGQSPLAAYEVDDSTG(SEQ ID NO: 10)實施例6 從灰腐質霉克隆耐熱性過氧化氫酶基因HCN6-1)基因組DNA文庫的制作采用實施例3-1所述的方法制備了灰腐質霉的基因組DNA文庫。6-2)探針的制作基于絲狀真菌和酵母來源過氧化氫酶的保守區域的序列，制作了以下引物。H 過氧化氫酶 F :GTNCGNTTYTCNACTGT (SEQ ID NO 11) H 過氧化氫酶 R :AARAANACNGGNTTRTTGTT (SEQ ID NO 12)[SEQ ID NO 12中，下劃線所示的符號“N”(12位)表示脫氧肌苷]使用H過氧化氫酶F和H過氧化氫酶R作為引物，以基因組DNA作為模板進行 了 PCR。PCR使用Ex Taq聚合酶(TAKARA Bio公司制造)實施。PCR通過實施30個循環 的98°C 10秒、55°C退火30秒、72°C延伸反應15秒的程序來實施。對于擴增出的300bp 的DNA片段，使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen公司制造)按照附帶規程將其插入 PCR2. 1-T0P0質粒載體，得到了質粒Τ0Ρ0-Η過氧化氫酶。對克隆在質粒Τ0Ρ0-Η過氧化氫酶中的插入DNA片段的堿基序列進行了分析，對 所得堿基序列的同源性檢索結果是與核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)來源的過氧化 氫酶顯示出高達97%的同一性，因而判斷該DNA片段是過氧化氫酶基因的一部分。以質粒 Τ0Ρ0-Η過氧化氫酶作為模板，采用與上述相同的方法通過PCR擴增了該DNA片段，使用ECL DirectSystem(Amersham Pharmacia Biotech公司制造)對所得PCR產物進行了標記，作為 探針。6-3)利用斑點雜交進行篩選采用實施例3-3所述的方法對基因組DNA文庫進行篩選，結果得到了 1個陽性克 隆。對所得陽性克隆進行了 Southern印跡分析，結果約7kb的片段與約4kb的MlHI 片段顯示出與染色體DNA共同的雜交圖樣。將所述片段與MmHI片段克隆在PUC118 中，分別得到了質粒pUC-HCN-XhoI和pUC-HCN-BamHl。對這些質粒的堿基序列進行了分析， 結果確認XimI片段中的SEQ ID NO 3的堿基序列的616位 3，末端的序列，以及MlHI 片段中的5’末端 SEQ ID NO :3的堿基序列的1675位的序列包含耐熱性過氧化氫酶基因 片段。通過將這些堿基序列結合，確定了全長耐熱性過氧化氫酶基因的堿基序列。為了對 灰腐質霉來源的過氧化氫酶基因HCN實施亞克隆，以灰腐質霉的基因組DNA作為模板，利用 以下引物組(HCNF以及HCNR)實施PCR，擴增了 HCN基因。HCNF :ATGAACAGAGTCACGAATCTC(SEQ ID NO 13)HCNR :TCAAAAAACAAAGGCACCAAG(SEQ ID NO 14)使用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen公司制造)將擴增得到的DNA插 入pCR2. 1-T0P0質粒載體，得到了質粒pHCN。通過用所得質粒pHCN轉化大腸桿菌 (Escherichia coli)T0P 10 株(Invitrogen 公司)，得到了 Escherichiacoli T0P10 株 / pHCN。6-4)耐熱性過氧化氫酶的氨基酸序列的推定采用上述方法從灰腐質霉基因組DNA分離出的全長耐熱性過氧化氫酶基因HCN由 SEQ ID N0:3所示的2749bp的堿基組成。基于由該堿基序列推定的氨基酸序列與已知過氧化氫酶的氨基酸序列之間的比較、以及內含子的保守序列，推定該基因包含SEQ ID NO 3的堿基序列的283 463位、667 747位、771 846位、1008 1160位、1218 1270 位、1842 1895位所示的6個內含子。由該堿基序列推定的耐熱性過氧化氫酶的氨基酸序 列如SEQID NO 4所示。此外，SEQ ID NO 4的氨基酸序列的1 20位的序列與實施例5 所示的從灰腐質霉純化得到的耐熱性過氧化氫酶的N末端氨基酸序列完全一致，因而推定 SEQ ID NO :4的氨基酸序列的-1 -32位的氨基酸序列是信號序列，并推定編碼該氨基酸 序列的SEQ ID NO 3的堿基序列的1 96位的序列是編碼信號序列的堿基序列。實施例7 重組PCN表達載體的制備使用下述表達載體來實施以黑曲霉大孢子變種(Aspergillus niger var. macrosporus)為宿主的重組PCN的表達，所述表達載體是在黑曲霉大孢子變種中顯著量表 達的Proctase B基因的啟動子與終止子之間插入PCN基因而得到的。該表達載體是按以 下規程制備的。7-1)基因組DNA文庫的制作從黑曲霉大孢子變種的菌體按照堀內等的方法[H. Horiuchi et. al.， J. Bacteriol.，170，272-278，(1988)]分離純化基因組DNA。將分離出的基因組DNA用 _3ΑΙ部分消化。使用連接試劑盒Ver.2(TAKARA Bio公司制造)將其連接到噬菌體載 體λ EMBL3克隆試劑盒(Stratagene公司制造)的_ΗΙ臂上。用乙醇將其沉淀后，溶 解于TE緩沖液中。對于連接混合物的總量，使用MaxPlax λ packerging kit (Epicenter technology公司制造)使之形成噬菌體粒子，并感染大腸桿菌XLl_blue MRA (P2)株。通過 該方法得到了包括1. 25X IO5個噬菌體的基因組DNA文庫。7-2)探針的制作對于黑曲霉大孢子變種的基因組DNA文庫，通過以Proctase B基因的翻譯區域作 為探針實施Southern印跡，分離出了包含Proctase B基因的啟動子和終止子區域的克隆。 Proctase B基因的翻譯區域是以黑曲霉大孢子變種的基因組DNA作為模板、使用基于特開 平5-68570號公報記載的Proctase B基因的翻譯區域的5’末端和3’末端序列設計的引 物(ProctaseB-N 和 ProctaseB-C)進行 PCR 擴增得到的。ProctaseB-N :ATGGTCGTCTTCAGCAAAACC(SEQ ID NO 15)ProctaseB-C CTAAGCCTGAGCGGCGAATCC(SEQ ID NO 16)PCR 使用 LA PCR KIT Ver2. 1 (TAKARA Bio 公司制造)進行。反應條件94°C 保溫1分鐘后，進行30個循環的(94°C、30秒)-(52°C、30秒)-(72°C、90秒)的循環，最 后72°C處理7分鐘，結束反應。結果擴增得到了約1.2kb的DNA。使用Τ0Ρ0 TA克隆試劑 盒(Invitrogen公司制造)按照試劑盒附帶的規程將擴增得到的1. 2kb的DNA片段插入 pCR2. 1-T0P0質粒載體，得到了質粒TOPO-ProB。克隆至質粒TOPO-ProB中的插入DNA片 段的測序使用 BigDye (R) Terminator v3. 1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems 公司制造)和ABI PRISM基因分析儀(Applied Biosystems公司制造)按照附帶規程進 行。其結果是所得堿基序列與特開平5-68570號公報記載的Proctase B基因的序列一 致，因而判斷該DNA片段是Proctase B基因的翻譯區域。將該DNA片段用ECL Direct System(Amersham Pharmacia Biotech 公司制造)標記，作為探針。7-3)利用斑點雜交篩選包含Proctase基因的啟動子區域和終止子區域的克隆
對于實施例7-1中制作的噬菌體斑點，將其轉印在Hybond N+尼龍轉印膜 (Amersham公司制造)上，堿變性后用5倍濃度SSC (SSC 15mmol/L檸檬酸三鈉、150mmol/L 氯化鈉)洗滌，進行干燥從而固定DNA。雜交是在1小時的預雜交(42°C )后，添加采用實 施例7-2所述的方法制備的探針，進行20小時(42°C)雜交。探針的洗滌是用添加6mol/L 尿素、0. 4% SDS的0. 5倍濃度SSC進行2次，再用2倍濃度SSC進行2次。對于進行過探 針洗滌的尼龍膜，將其在檢測溶液中浸漬1分鐘浸漬后，用同一公司制造的HYPER FilmECL 進行感光，得到了 8個陽性克隆。使用LE392作為宿主大腸桿菌，按照Maniatis等的方法(J. Sambrook, E.F. Fritsch and Τ. Maniatis, “ Molecular Cloning" ,Cold SpringHarbor La boratory Press. 1989)從陽性克隆制備DNA。首先，將LE392用LB-MM培養基(1%蛋白胨、0.5%酵母 提取物、0.5%氯化鈉、lOmmol/L硫酸鎂、0.2%麥芽糖)培養過夜。使之感染單個斑點來源 的噬菌體溶液，用LB-MM培養基培養過夜。向其中加入終濃度lmol/L的氯化鈉，再加入終 濃度0.8%的氯仿，促進大腸桿菌的溶菌。通過離心分離除去菌體殘渣，從聚乙二醇(PEG) 沉淀(10%PEG6000)回收了噬菌體粒子。在SDS存在下，用蛋白酶K消化噬菌體粒子，并通 過對其進行苯酚處理、乙醇沉淀來回收了噬菌體DNA。對于如上制備的DNA，使用ECL Direct System進行了 Southern印跡分析。以采 用實施例7-2所述的方法制備的探針進行雜交，結果約5. 5kb的XimI-EmRI片段顯示出與 染色體DNA共同的雜交圖樣，因而判斷該片段是包含Proctase B基因的片段，并實施了亞 克隆。將從噬菌體DNA中切下的XhoI-EcoRI片段插入pUC119的Sail.EcoRI部位，得到了 質粒PPR0B/119E.X。對所得質粒的堿基序列進行了分析，測定了 Proctase B基因的啟動 子、終止子區域的堿基序列。7-4)基因表達用重組載體pPTB-EX的構建從采用實施例7-3記載的方法制備的質粒pPR0B/119E. X中刪除Proctase B基因 的翻譯區域，將該基因的啟動子的3’末端與終止子區域的5’側末端通過XMI識別序列連 接起來，由此得到的載體為表達載體pPTB-EX。pPTB-EX是以pPR0B/119E. X作為模板，通過 使用作為Proctase B基因的啟動子的3’側末端的引物(ProctaseBNxba)、作為Proctase B基因的終止子的5’側末端的引物(ProctaseBCxba)的反向PCR來制備的。ProctaseBNxba :GGTCTAGAATGTCAAGCAAGAGAGT(SEQ ID NO 17)ProctaseBCxba :GGTCTAGAATCAACCACTGAAGTGGA(SEQ ID NO 18)而且，在兩引物5，側末端添加了識別序列。PCR是使用PrimestarMAX DNA POLYMERASE (TAKARA Bio 公司制造)，進行 30 個循環的(98°C、10 秒)-(55°C、5 秒)-(72 V、 60秒)的反應。其結果，擴增出了約7kb的DNA。對于PCR反應液，使用QIAQUICK PCR PURIFICATIONKIT(QIAGEN公司制造)進行DNA的純化，將其洗脫到50 μ L的TE緩沖液中， 將所得DNA片段用SmI進行限制酶處理后，使用連接試劑盒Ver. 2(TAKARA Bio公司制造) 進行再連接，得到了表達載體pPTB-EX。對所得質粒的堿基序列進行分析，確認反向PCR未 引入突變。7-5)重組PCN表達用載體pPTPCN的構建對于采用實施例3所述的方法分離得到的PCN基因，將其插入表達載體pPTB-EX 的XMI位點，從而構建了重組PCN表達用載體pPTPCN。為了在PCN基因翻譯區域的5’側末端和3’側末端添加X^I識別序列，以pPCN為模板，使用在PCN基因的翻譯區域的5’側末端和3’側末端添加X^I識別序列而得到的引物PCN-XbaIPtN和PCN-XbaIPtC進行了 PCR。PCN-XbaIPtN :GGTCTAGAGGTCAAAATGCGAGGATTATACTCCCT(SEQ ID NO: 19)PCN-XbaIPtC :GGTCTAGACTACTCATCCACAGCGAATCGG(SEQ IDNO 20)PCR是使用Primestar MAX DNA POLYMERASE(TAKARA Bio公司制造)，進行30個循 環的(981、10秒)-(551、5秒)-(721、60秒)的反應。其結果，擴增得到了約2. 3kb的 DNA。對于 PCR 反應液，使用 QIAQUICK PCRPURIFICATION KIT (QIAGEN 公司制造)進行了 DNA 的純化，將其洗脫到50 μ L的TE緩沖液中，將所得DNA片段用進行限制酶處理后，使 用同樣用XMI消化后再進行脫磷酸化處理而得到的pPTB-EX和連接試劑盒Ver. 2 (TAKARA Bio公司制造)進行連接，從而得到了質粒pPTPCN(SEQ IDN0:21，圖3)。對該質粒中插入 的PCN的DNA序列進行分析，確認了 PCR未引入突變。實施例8 用PCN表達載體pPTPCN轉化黑曲霉大孢子變種以及重組PCN的表達基于PCN表達載體pPTPCN的黑曲霉大孢子變種的轉化，通過以niaD基因作為選 擇標記基因轉化該株的niaD缺損株來實施。·8-1) niaD缺損株Nia2株的分離將黑曲霉大孢子變種的孢子涂布于在SPEC培養基-N(0. K2HP04、0.05% MgSO4 · 7Η20、0· 05% KC1、0. 001% FeSO4 · 2H20、3%蔗糖、1· 5% PurifiedAgar (精制瓊脂)、 pH5. 5 6. 0)中添加0. 188%谷氨酸鈉和3% KClO3而得到的培養基。將30°C培養5 7 天后所得的菌落分別復制到以N03、NH4或谷氨酸作為SPEC培養基的N源而得到的培養基 上，30°C培養5 7天。在復制的菌落中，分離出能夠在以NH4和谷氨酸作為N源的培養基 上生長繁育、但不能在以NO3作為N源的培養基上生長繁育的菌株，此為niaD缺損株Nia2 株。8-2)選擇標記基因niaD基因的分離基于 Uncle 等[Uncle, S. Ε. , Cambe 11, Ε. I. , Punt, P. J. , Hawker, K. L. , Contreras, R. , Hawkins, Α. R. , Van Den Hondel, C. Α. and Kinghorn, J. R. , " TheAspergillus niger niaD gene encoding nitrate reductase upstream nucreltide andamino acid sequence comparisons"，Gene 111 (2)，149-155 (1992)]報告的黑曲霉 niaD 基因翻譯區域的 5，末 端和3’末端設計引物Nia-N和Nia-C，通過使用引物Nia-N和Nia-C進行PCR，擴增了黑曲 霉大孢子變種的niaD基因的翻譯區域。Nia-N :ATGGCGACTGTCACTGAGGTG(SEQ ID NO 22)Nia-C :TTAGAAGAAATGAAGGTCCGA(SEQ ID NO 23)PCR如下實施以黑曲霉大孢子變種的基因組DNA為模板，使用LAPCR KIT Ver2. 1 (TAKARA Bio 公司制造)，94°C 1 分鐘后，進行 30 個循環的(94C、30 秒)-(55°C、30 秒)-(72°C、3分鐘)的循環，最后72°C處理7分鐘。其結果，擴增得到了約3kb的DNA。將 擴增得到的 3kb 的 DNA 片段用 ECL Direct System(Amersham Pharmacia Biotech 公司制 造)進行標記，作為探針。接著，以采用所述方法制備的niaD基因的翻譯區域為探針，從采用實施例7_1所 述的方法制備的黑曲霉大孢子變種的基因組DNA文庫分離出了包含niaD基因的啟動子區域、終止子區域的克隆。采用與實施7相同的方法對基因組DNA文庫進行篩選，得到了 1個 陽性克隆。對于所得噬菌體克隆，采用與實施例7相同的方法進行了 Southern印跡分析。 其結果，約6. 5kb的X^I消化片段顯示出與染色體DNA共同的雜交圖樣，因而將該X^I片 段克隆到PUC118的X^I識別序列部位，從而得到了質粒pPTniallS。對所得質粒的堿基 序列進行了分析，測定了包含niaD基因的啟動子和終止子區域的6416bp的堿基序列(SEQ ID NO 24)。8-3)將PCN基因導入黑曲霉大孢子變種Nia2株將黑曲霉大孢子變種Nia2株用S培養基(3. 0%葡萄糖、0. 多蛋白胨、酵母 提取物、0. 14%硫酸銨、0. 2%磷酸鉀、0. 03%硫酸鎂、pH6. 8)于30°C培養24小時，通過離 心分離(3500rpm、10分鐘)回收了菌體。將所得菌體用0. 5mol/L蔗糖洗滌，將其懸浮于用
0.45 μ m的濾膜過濾過的原生質體化酶溶液(10mg/mL β -葡糖醛酸糖苷酶、3mg/mL甲殼 酶、3mg/mL消解酶(zymolase)、0. 5mol/L蔗糖)中。30°C振蕩60分鐘，將菌絲原生質體化。 用脫脂棉過濾該懸浮液后，2500rpm離心10分鐘回收原生質體，并用SUTC緩沖液(17. 1% 蔗糖、10mmol/L Tris-HCl pH7. 5、10mmol/L CaCl2)洗滌。將如上制備的原生質體再懸浮于 100 μ L 的 SUTC 緩沖液后，添加 PPTPCN7. 5 μ L (1 μ g/ μ L)禾口 pPTnial 182. 5 μ L (1 μ g/ μ L)， 冰上靜置 5 分鐘。然后，添加 400μ L 的 PEG 溶液(60% PEG4000、likimol/L Tris-HCl pH7. 5、 10mmol/LCaCl2)并于冰上靜置20分鐘后，添加SUTC緩沖液10mL，2500rpm離心10分鐘。將 離 心分離出的原生質體懸浮于ImL的SUTC緩沖液后，4000rpm離心5分鐘，最后將其懸浮于 100μ L的SUTC緩沖液中。將經過以上處理得到的原生質體與軟瓊脂一起鋪層在SPEC再生培養基(0. 085% NaN03、0. 1 % Κ2ΗΡ04、0· 05 % MgSO4 · 7Η20、0· 05 % KCl、0· 001 % FeSO4 · 2Η20、17· 1 % 蔗糖、
1.5% Purified Agar、pH5. 5 6. 0)上，將30°C培養5 7天而形成的菌落作為轉化體。8-4)黑曲霉大孢子變種Nia2株轉化體中PCN的表達與酶活性的測定將所得轉化體用P培養基(1. 0%淀粉、6. 0%脫脂大豆粕、1. 0%玉米漿、0. 3%硫 酸銨、碳酸鈣)28°C培養6天。通過SDS-PAGE對培養后的上清進行了分析，得到了能夠 觀察到重組PCN來源的分子量約SOkDa的條帶的菌株(No. 16株)。對于No. 16株的培養上 清、以及同樣培養Ma2株所得的培養上清，采用實施例1所述的方法測定了過氧化氫酶活 性。其結果如表1所述，No. 16顯示出親本株的77倍以上的活性，確認到了重組PCN的表 達。[表 1]
過氧化氫酶活性(u/mL) 親本株小于300u/mL
No.16 株23300u/mL 而且，在過氧化氫酶活性方面，以1分鐘分解1 μ mol的過氧化氫的酶量為1個單 位。而且，測定了采用實施例1所述的方法得到的嗜松青霉的培養上清的過氧化氫酶活性， 其活性為385U/mL。該結果顯示通過以黑曲霉大孢子變種作為宿主表達PCN，其生產性顯者提尚。8-5) N末端氨基酸序列的分析對實施例8-4所得轉化體No. 16株的培養上清進行SDS-PAGE，并轉印到 Millipore公司制造的PVDF膜(Immobilon-PSQ)上。將該PVDF膜用考馬斯亮藍染色，切下 印跡出約SOkDa的蛋白質的部分，用Model 492氨基酸測序儀進行分析，解讀出氨基末端側 11個殘基的氨基酸序列。該序列如下。DDSNASSETEA(SEQ ID NO :5 的 1 11 位)該氨基酸序列與嗜松青霉來源PC N的N末端氨基酸序列相同，因此，確認約SOkDa 的蛋白質是重組PCN。8-6)重組PCN的熱穩定性研究如實施例1所述，嗜松青霉產生的天然PCN的熱穩定性是50%。采用實施例1所 述的方法對通過實施例8-4所述的方法得到的重組PCN的熱穩定性進行了評價，結果其穩 定性是71. 3%。以上結果表明重組PCN的熱穩定性與天然PCN相比顯著提高。以上，通過具體實施方式
對本發明進行了說明，而本發明的范圍中包括對本領域 技術人員而言顯而易見的變形和改良。序列表的SEQ ID NO :6-9、11-20、22_23的各堿基序列是人工合成的引物序列， 其分別為引物 P catalase F(SEQ ID NO :6)、P catalase R(SEQ IDNO 7)、PCNF(SEQ ID NO 8)、PCNR(SEQ ID NO :9)、H catalase F(SEQ IDNO :11)、H catalase R(SEQ ID NO 12)、HCNF (SEQ ID NO 13)、HCNR (SEQID NO 14)、ProctaseB-N (SEQ ID NO: 15)、 ProctaseB-C(SEQ ID NO 16)、ProctaseBNxba(SEQ ID NO : 17)、ProctaseBCxba(SEQ ID NO: 18)、PCN-XbaIPtN(SEQ ID NO 19)、PCN-XbaIPtC(SEQ ID NO 20)、Nia-N(SEQID NO 22)、 Nia-C(SEQ ID NO 23)。SEQ ID NO 21的堿基序列是質粒pPTPCN。SEQ ID N0:6 的符號“N”(18 位)、SEQ ID NO 11 的符號“N”(3、6、12 位)、SEQ ID NO 12的符號“N” (6、9位)分別表示任意堿基，而SEQ IDNO 12的符號“N” (12位)表示
脫氧肌苷。
權利要求
屬于青霉屬的微生物產生的耐熱性過氧化氫酶。
2.根據權利要求1所述的耐熱性過氧化氫酶，其中，屬于青霉屬的微生物是嗜松青霉 (Penicillium pinophilum)。
3.根據權利要求1或2所述的耐熱性過氧化氫酶，其分子量是約80kDa。
4.灰腐質霉(Humicolagrisea)產生的耐熱性過氧化氫酶。
5.根據權利要求4所述的耐熱性過氧化氫酶，其分子量是約80kDa。
6.選自以下的(i)、(ii)和(iii)中的蛋白質(i)包含SEQID NO 2所述的氨基酸序列的1 692位的序列的蛋白質；(ii)包含在SEQID NO 2所述的氨基酸序列的1 692位的序列中缺失、取代或添加 1個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列、且具有耐熱性過氧化氫酶活性的蛋白質；(iii)包含與SEQID NO :2所述的氨基酸序列的1 692位的序列具有70%以上同一 性的氨基酸序列、且具有耐熱性過氧化氫酶活性的蛋白質。
7.由SEQID NO :2所述的氨基酸序列的1 692位的序列組成的、具有耐熱性過氧化 氫酶活性的蛋白質。
8.根據權利要求6或7所述的蛋白質，該蛋白質的N末端側具有SEQIDNO :2所述的 氨基酸序列的-1 -42位的序列、或者在SEQ ID NO 2所述的氨基酸序列的_1 _42位 的序列中缺失、取代或添加1個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列。
9.選自以下的(i)、(ii)和(iii)中的蛋白質(i)包含SEQID NO 4所述的氨基酸序列的1 684位的序列的蛋白質；(ii)包含在SEQID NO 4所述的氨基酸序列的1 684位的序列中缺失、取代或添加 1個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列、且具有耐熱性過氧化氫酶活性的蛋白質；(iii)包含與SEQID NO :4所述的氨基酸序列的1 684位的序列具有70%以上同一 性的氨基酸序列、且具有耐熱性過氧化氫酶活性的蛋白質。
10.由SEQID NO :4所述的氨基酸序列的1 684位的序列組成的、具有耐熱性過氧 化氫酶活性的蛋白質。
11.根據權利要求9或10所述的蛋白質，該蛋白質的N末端側具有SEQIDNO :4所述 的氨基酸序列的-1 -32位的序列、或者在SEQ ID NO :4所述的氨基酸序列的-1 -32 位的序列中缺失、取代、或添加1個或多個氨基酸而得到的氨基酸序列。
12.選自以下的(i)、(ii)和(iii)中的DNA:(i)編碼權利要求6 8中任一項所述的蛋白質的DNA；(ii)包含SEQID NO 1所述的堿基序列的1 2403位的序列的DNA ；(iii)與由SEQID NO 1所述的堿基序列的1 2403位的序列組成的DNA在嚴格條 件下雜交、且編碼具有耐熱性過氧化氫酶活性的蛋白質的DNA。
13.由SEQID NO 1所述的堿基序列的1 2403位的序列組成的DNA。
14.從權利要求12或13所述的DNA中除去內含子序列而得到的DNA。
15.根據權利要求14所述的DNA，其中，內含子序列是選自SEQIDNO :1所述的堿基序 列的322 372位、599 651位、1068 1113位或1279 1326位的序列中的1個以上 的序列。
16.從權利要求12 15中任一項所述的DNA中除去編碼信號序列的堿基序列而得到的 DNA。
17.根據權利要求16所述的DNA，其中，編碼信號序列的堿基序列是SEQID N0:1所述 的堿基序列的1 126位的序列。
18.選自以下的⑴、(ii)和(iii)中的DNA:(i)編碼權利要求9 11中任一項所述的蛋白質的DNA;(ii)包含SEQID NO 3所述的堿基序列的1 2749位的序列的DNA ；(iii)與由SEQID NO 3所述的堿基序列的1 2749位的序列組成的DNA在嚴格條 件下雜交、且編碼具有耐熱性過氧化氫酶活性的蛋白質的DNA。
19.由SEQID NO 3所述的堿基序列的1 2749位的序列組成的DNA。
20.從權利要求18或19所述的DNA中除去內含子序列而得到的DNA。
21.根據權利要求20所述的DNA，其中，內含子序列是選自SEQIDNO 3所述的283 463 位、667 747 位、771 846 位、1008 1160 位、1218 1270 位或 1842 1895 位的 序列中的1個以上的序列。
22.從權利要求18 21所述的DNA中除去編碼信號序列的堿基序列而得到的DNA。
23.根據權利要求22所述的DNA，其中，編碼信號序列的堿基序列是SEQID N0:3所述 的1 96位的序列。
24.包含權利要求12 17中任一項所述的DNA的表達載體。
25.用權利要求12 17中任一項所述的DNA或權利要求24所述的表達載體轉化的宿 主微生物。
26.根據權利要求25所述的宿主微生物，其中，該宿主微生物為絲狀真菌。
27.根據權利要求26所述的宿主微生物，其中，絲狀真菌是選自屬于曲霉屬 (Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、腐質霉屬(Humicola)、木霉屬(Trichoderma)或頂 孢霉屬(Acremonium)的絲狀真菌中的絲狀真菌。
28.耐熱性過氧化氫酶的生產方法，該生產方法包括培養權利要求25 27中任一項 所述的宿主微生物，并從培養物收集耐熱性過氧化氫酶。
29.包含權利要求18 23中任一項所述的DNA的表達載體。
30.用權利要求18 23中任一項所述的DNA或權利要求29所述的表達載體轉化的宿 主微生物。
31.根據權利要求30所述的宿主微生物，其中，該宿主微生物是絲狀真菌。
32.根據權利要求31所述的宿主微生物，其中，絲狀真菌是選自屬于曲霉屬、青霉屬、 腐質霉屬、木霉屬或頂孢霉屬的絲狀真菌中的絲狀真菌。
33.耐熱性過氧化氫酶的生產方法，該生產方法包括培養權利要求30 32中任一項 所述的宿主微生物，并從培養物收集耐熱性過氧化氫酶。
全文摘要
本發明的課題是以重組蛋白質的形式大量表達耐熱性過氧化氫酶，高效且廉價地生產耐熱性過氧化氫酶。通過獲得以重組蛋白質的形式高效地生產耐熱性過氧化氫酶所必需的DNA，能夠得到高效表達耐熱性過氧化氫酶的重組微生物。而且，通過培養所得的重組微生物，能夠高效且廉價地生產耐熱性過氧化氫酶。通過用本發明的耐熱性過氧化氫酶處理含過氧化氫的溶液，即使在高溫下也能夠有效且廉價地分解過氧化氫。
文檔編號C12N15/09GK101970658SQ20098010550
公開日2011年2月9日 申請日期2009年2月18日 優先權日2008年2月18日
發明者岡倉薰, 村島弘一郎, 福島崇惠, 間塚風介 申請人:明治制果株式會社