專利名稱：基于偕胺肟pan納米纖維膜為載體的固定過氧化氫酶的方法
技術領域：
本發明涉及一種以偕胺肟PAN納米纖維膜為載體的固定化酶的方法，具體涉及利 用靜電紡絲制備PAN納米纖維膜，通過胺肟化改性制備偕胺肟PAN納米纖維膜，并以其作為 新型的酶固定載體，通過金屬配位結合固定過氧化氫酶的方法。
背景技術：
酶是一種催化效率高、專一性強(如底物特異性，立體異構特異性)的生物催化 劑。但由于酶的蛋白質特征，凡是能夠引起蛋白質變性的因素都可能會造成酶的失活，如 PH、重金屬鹽、熱、紫外線、劇烈震蕩等。即使在最適催化條件下，隨著反應時間的延長，酶 催化反應速度也會逐漸下降。此外，自由酶在催化后難以回收，給產物分離和提純都造成困 難，導致生產成本提高。這些因素都極大地限制了酶在現代工業中的應用。酶的固定化技 術可有效地束縛酶的構象，是穩定酶活性的重要方法之一。它在節能、環保、降低成本以及 生產連續化等方面顯示了巨大的潛在應用價值，為酶的應用提供了廣闊的前景。本發明中 固定的過氧化氫酶在清除超氧自由基、H2O2和過氧化物以及阻止或減少羥基自由基形成等 方面發揮重要作用，并被廣泛應用到食品、紡織、造紙、環保和醫療等領域。關于過氧化氫酶的固定，國內外也有相關的論文發表和專利公布。國際上，如 Cetinus將過氧化氫酶固定在用戊二醛預處理的殼聚糖膜上，研究了固定化酶的動力學參 數、熱穩定性、貯存穩定性和操作穩定性。Horst分析了以磁鐵礦(Fe3O4)為載體用戊二醛 交聯固定過氧化氫酶，并研究了其分解過氧化氫的活力。Domink采用了溶膠-凝膠法固定 過氧化氫酶，并探討了固定化酶的催化活性和重復使用性。Opwis等則將過氧化氫酶固定在 紡織纖維材質上，采用氰脲酰氯在棉織物上固定過氧化氫酶，還研究了在尼龍6織物上采 用戊二醛交聯固定過氧化氫酶。Costa等利用無機材質氧化鋁(礬土)經戊二醛交聯固定 過氧化氫酶，用于處理氧漂廢水，回收并用于染色。國內，如浙江大學朱祥瑞利用家蠶絲素 固定化過氧化氫酶并研究其理化特性。江南大學陳堅等以殼聚糖為載體，吸附交聯固定化 過氧化氫酶，并將其應用于香煙過濾嘴中，對香煙的主流煙氣自由基的清除效果明顯(專 利號:200610039838)。靜電紡絲制得的納米纖維空隙率高，比表面積大，可作為理想的酶固定化載體，相 對于傳統的酶固定載體，如微球、常規薄膜或普通纖維等，具有明顯的優勢。靜電紡PAN納 米纖維經胺肟化改性制得的偕胺肟PAN納米纖維形態穩定，孔隙率高，其良好的孔洞連通 性可有效提高其負載催化劑的能力，同時降低底物的擴散阻力，具有很強的離子吸附能力 和生物親和性。經查閱，目前尚無用胺肟化改性的偕胺肟PAN納米纖維膜作為酶固定載體 的專利公布或論文發表。將偕胺肟PAN納米纖維膜作為酶固定的載體，是本發明的重點創 新內容。分析傳統的酶固定方法，雖具有各自的優勢和特點，但同時也具有一定的缺陷。例 如吸附法操作容易，對酶活力影響較小，但酶與載體之間的結合力較低，難以重復使用；而通過共價鍵固定，雖然結合力較強，但對酶的構象有嚴重影響，使酶的活性大幅降低。本發 明中，利用載體上的功能基團使之與金屬離子間形成絡合物，再通過配位鍵與酶端的功能 基團結合固定酶，較好的克服傳統固定方法的不足，具有結合力較強，酶活力回收率高的特 點。本發明中將配位結合應用于過氧化氫酶固定化，是對過氧化氫酶固定化方法的進一步 拓展。
發明內容
本發明的目的是提供一種以偕胺肟PAN納米纖維膜為載體的固定化酶的方法，經 過對靜電紡PAN納米纖維進行胺肟化改性，制得新型的酶固定載體——偕胺肟PAN納米纖 維膜，以二價銅離子為中心體，通過配位結合在偕胺肟PAN納米纖維上固定化過氧化氫酶。為達到上述目的，本發明采用的的技術方案為偕胺肟PAN納米纖維固定過氧化氫 酶方法，步驟為1、將重均分子量為79100的PAN溶于N，N-二甲基甲酰胺中，制得質量百分比為 10-12%的紡絲溶液，用于靜電紡絲；靜電紡絲工藝參數為噴絲頭與接收板距離15-17cm， 紡絲液流速0. 4-0. 6mL/min,噴絲頭直徑0. 7mm,施加18-20KV的靜電壓，通過鋁箔接收，接 收時間為20-25小時。2、將靜電紡PAN納米纖維在濃度為0. 5mol/L、pH為5. 5-6. 5的鹽酸羥胺溶液中浸 泡120-150分鐘，用蒸餾水清洗3-5次，制得偕胺肟PAN納米纖維膜。3、將制得的偕胺肟PAN納米纖維在20-30°C條件下浸泡于0. 05mol/L的二氯化銅 溶液中，時間為15-20小時，用蒸餾水洗去表面團聚的銅離子。4、配置PH為7. 0、濃度為50mmol/L的磷酸鹽緩沖液，將過氧化氫酶溶解于pH為 7. 0的磷酸鹽緩沖液中，過氧化氫酶溶液濃度為0. 3-0. 5mg/mL。5、將經過銅離子配合后的偕胺肟PAN納米纖維膜在濃度為0. 3-0. 5mg/mL的酶溶 液中振蕩浸泡4小時，于20°C固定，再用pH為7. 0的磷酸鹽緩沖液沖洗3-5遍，制得偕胺肟 PAN納米纖維膜固定化過氧化氫酶。由于采用了上述技術方案，本發明具有如下優點和效果1、本發明采用靜電紡PAN納米纖維經胺肟化改性制得的偕胺肟PAN納米纖維膜作 為固定化酶的載體，形態穩定、孔隙率高，負載能力強，降低底物的擴散阻力，并具有良好的 生物親和性。2、本發明所得的偕胺肟PAN納米纖維固定過氧化氫酶活力回收率高，最適pH范圍 擴大，熱穩定性和存儲穩定性好。
圖1制備偕胺肟PAN納米纖維膜并固定化過氧化氫酶工藝流程。圖2偕胺肟PAN納米纖維膜(掃描電子顯微鏡)。
具體實施例方式實施例將2克重均分子量為79100的PAN溶于N，N-二甲基甲酰胺中，制得20mL質量百分比為10%的紡絲溶液，置于自制的靜電紡絲設備。靜電紡絲工藝參數為噴絲頭與接收 板距離17cm，紡絲液流速0. 5mL/min,噴絲頭直徑0. 7mm,施加18KV的靜電壓，通過鋁箔接 收，接收時間為22小時。隨后在真空干燥箱中干燥2小時，去除剩余溶劑，得到PAN納米纖
維膜。 配置0. 5mol/L的鹽酸羥胺溶液，用碳酸鈉調節pH值為6. 0 ；將0. 2克靜電紡PAN 納米纖維在50mLpH值為6. 0、濃度為0. 5mol/L的鹽酸羥胺溶液中浸泡120分鐘，用蒸餾水 清洗4次，制得偕胺肟PAN納米纖維膜。將制得的偕胺肟PAN納米纖維在20°C條件下浸泡于0. 05mol/L的二氯化銅溶液 中，時間為20小時，用蒸餾水沖洗5次，去除表面團聚的銅離子，制得配合了銅離子的偕胺 肟PAN納米纖維膜。配置pH為7. 0、濃度為50mmol/L的磷酸鹽緩沖液，用稀鹽酸調節pH為7. 0，將15mg 的過氧化氫酶溶解于50mLpH為7. 0的磷酸鹽緩沖液中，制得濃度為0. 3mg/mL的過氧化氫 酶溶液。將制得的配合有銅離子的偕胺肟PAN納米纖維膜在50mL酶溶液中振蕩浸泡4小 時，于20°C固定，再用pH為7.0的磷酸鹽緩沖液沖洗3遍，將游離的過氧化氫酶洗去，制得 基于偕胺肟PAN納米纖維膜為載體的固定化過氧化氫酶。
權利要求
1.基于偕胺肟PAN納米纖維膜為載體的固定過氧化氫酶的方法，其特征是利用靜電紡 絲獲取PAN納米纖維，并對其進行胺肟化改性制得偕胺肟PAN納米纖維膜，再以二價銅離子 為中心體，通過配位結合在偕胺肟PAN納米纖維膜上固定化過氧化氫酶。
2.如權利1所述的基于偕胺肟PAN納米纖維膜為載體的固定過氧化氫酶的方法，其 特征在于過氧化氫酶的固定化載體是將靜電紡PAN納米纖維在濃度為0. 5mol/L、pH為 5. 5-6. 5的鹽酸羥胺溶液中浸泡120-150分鐘，用蒸餾水清洗3_5次，制得形態穩定、孔隙率 高，負載能力強并具有良好的生物親和性的偕胺肟PAN納米纖維膜。
3.如權利1所述的基于偕胺肟PAN納米纖維膜為載體的固定過氧化氫酶的方法，其特 征在于將制得的偕胺肟PAN納米纖維膜在20-30°C條件下浸泡于0. 05mol/L的二氯化銅 溶液中，時間為15-20小時，用蒸餾水洗去表面團聚的銅離子。
4.如權利1所述的基于偕胺肟PAN納米纖維膜為載體的固定過氧化氫酶的方法，其特 征在于配置PH為7. 0濃度為50mmol/L的磷酸鹽緩沖液，用稀鹽酸調節pH為7. 0，將過氧 化氫酶溶解于pH為7. 0的磷酸鹽緩沖液中，酶溶液濃度為0. 3-0. 5mg/mL。
5.如權利1所述的基于偕胺肟PAN納米纖維膜為載體的固定過氧化氫酶的方法，其特 征在于將經過銅離子配合后的偕胺肟納米纖維膜在酶溶液中振蕩浸泡4小時，于20°C固 定，再用PH為7. 0的磷酸鹽緩沖液沖洗3-5遍，制得偕胺肟PAN納米纖維膜固定化過氧化 氫酶。
全文摘要
基于偕胺肟PAN納米纖維膜為載體的固定過氧化氫酶的方法，涉及利用靜電紡絲制備納米纖維膜、PAN功能化改性和酶固定技術領域。利用靜電紡絲獲取PAN納米纖維膜，對其進行胺肟化改性制得形態穩定，孔隙率高，具有很強負載能力和生物親和性的偕胺肟PAN納米纖維膜，再以二價銅離子為中心體，通過配位結合在偕胺肟PAN納米纖維膜上固定化過氧化氫酶。與常規的過氧化氫酶固定化方法相比，本發明解決了固定化過氧化氫酶酶活力回收率低，存儲穩定性不搞，重復使用性能不穩定等缺點。發明制備的基于偕胺肟PAN納米纖維膜為載體的固定化過氧化氫酶可用于制備生物傳感器、膜生物反應器、環保材料等多個領域。
文檔編號C12N11/08GK102102097SQ20101058181
公開日2011年6月22日 申請日期2010年12月10日 優先權日2010年12月10日
發明者喬輝, 鳳權, 王清清, 魏取福, 黃鋒林 申請人:江南大學